共表达猪流行性腹泻病毒S1与GM-CSF蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1与GM-CSF融合基因的重组腺病毒,通过FMDV的2A基因序列做为Linker将密码子优化的S1基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因连接。构建重组穿梭质粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m),并将其电转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183感受态细胞中,通过同源重组制备重组腺病毒质粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒rAd-GMCSF2A-S1。间接免疫荧光和Western blot结果显示,S1和GMCSF蛋白在重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中获得表达。该重组腺病毒的制备为PEDV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.     

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒（JEV）的NS1基因,通过Sal Ⅰ＋EcoR Ⅰ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中.重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确.将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒.PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1.     

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆茵Vallee III株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后.亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经Pme I酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-I的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83.Pac I酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10 d后出现细胞病变(CPE).PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达.     

PRRSV GP5和PCV2 ORF2双基因共表达重组腺病毒的构建及鉴定

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因和猪圆环病毒2(PCV2)ORF2双基因共表达重组腺病毒.将扩增的PRRSV GP5基因和PCV2 ORF2基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293 A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有GP5和ORF2基因,western blot检测结果表明GP5基因和ORF2基因在293 A细胞内获得表达.     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

表达小反刍兽疫病毒F基因重组腺病毒的构建及对小鼠的免疫原性

为构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)F蛋白的重组腺病毒,本实验合成密码子优化的PPRV F基因,将其克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以Pme I线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组构建表达PPRV F蛋白的重组腺病毒质粒pAdV-F,经Pac I线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rHAdV-F.经PCR和Dot-ELISA鉴定,F蛋白在AD-293细胞中获得表达.该重组腺病毒与野生型腺病毒复制能力相近,但病毒滴度略低.间接ELISA方法检测显示rHAdV-F可以诱导小鼠产生抗PPRV特异性体液免疫应答.     

猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中.经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV.重组穿梭质粒用Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒.将构建的重组腺病毒按照每100μL 1×107蚀宽单位(PFU)滴鼻2次免疫6～8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清.用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究.     

携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定

从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达

根据PCV2Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因（702bp）。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体（pAdeasy-1）共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Westernblot检测证明PCV2Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。     

猪O型口蹄疫病毒P1/3C基因共表达重组腺病毒的构建与鉴定

通过PCR和RT-PCR扩增出目的基因,将FMDV P1和3C基因通过IRES串联,构建出重组腺病毒穿梭质粒,在BJ5173细菌中同源重组获得同源重组腺病毒质粒,转化XL1-Gold超级感受态细胞以扩大培养,PacⅠ酶切后转染AD-293细胞,纯化获得了重组腺病毒。该重组腺病毒于AD-293细胞连续传代培养,初步浓缩后TCID50为1010.71/mL。应用O型口蹄疫病毒阳性血清进行间接荧光抗体试验,病毒感染的AD-293细胞可见清晰荧光,证明该重组腺病毒对目的基因进行了成功的表达,为FMDVP1/3C基因共表达腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV） VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒（Human adenovirus serotype-5，HAdV-5），以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2；PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞，利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2；将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞，包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5（rAd5-VP2），将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞（Vero、CEF和DF1细胞）并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养，测得第10代病毒的滴度为7.9×10⁹ IFU/mL；RT-PCR结果显示，VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译；Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达，蛋白分子质量为41 ku；将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达，表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5，该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。