猪主动脉夹层模型的建立

目的在非体外循环下建立猪急性StanfordB型主动脉夹层模型,为临床探讨主动脉夹层治疗方法提供实验手段。方法将10头小猪分为两组,均在非体外循环下进行。组(n=4)通过主动脉侧壁钳钳夹部分降主动脉,切开主动脉侧壁,分离主动脉中、内1/3管壁,通过升高血压冲击主动脉壁,建立急性StanfordB型主动脉夹层模型;组(n=6)先建立猪左颈动脉-左股动脉转流,完全阻断降主动脉,其余步骤同组。结果组未形成夹层及假腔,组除1头猪因术中气管插管脱出而窒息死亡,其余5头主动脉夹层均形成,剪开主动脉壁,见夹层及假腔向远端扩展达膈肌水平,长度约14～18cm,光学显微镜下观察,见夹层在主动脉中层产生。结论通过预置左颈动脉-左股动脉转流,完全阻断降主动脉,机械分离主动脉壁,利用升高血压冲击主动脉壁,造成夹层分离,可以成功建立猪急性StanfordB型主动脉夹层模型。     

原代猪肝细胞及主动脉内皮细胞的提取和培养

目的建立有效高活力的原代猪肝细胞和主动脉内皮细胞提取和培养的方法。为异种移植排斥反应的靶细胞——血管内皮细胞和肝细胞的研究提供基础。方法从野生巴马猪分离肝脏和主动脉血管,通过蠕动泵灌注Ⅱ型胶原酶消化的方法提取猪肝细胞,低速离心和差速贴壁法纯化肝细胞,过碘酸雪夫(PAS)染色、白蛋白与肝细胞核因子4α免疫荧光染色对原代肝细胞进行鉴定;利用Ⅰ型胶原酶血管管腔灌注消化法提取猪主动脉内皮细胞,并通过检测因子Ⅷ相关抗原vWF及内皮细胞吞噬乙酰化低密度脂蛋白的方法进行鉴定。结果通过本文方法提取到了大量高活力的原代猪肝细胞和主动脉内皮细胞,猪肝细胞可以连续培养一周,内皮细胞可进行传代培养和冻存。两种细胞分别表达肝细胞和内皮细胞标志性蛋白。结论本研究提供的原代猪内皮细胞和肝细胞提取方法是制备大量高活力的原代内皮细胞及肝细胞的可靠方案。     

小分子干扰RNA转染猪血管内皮细胞优化体系的建立

目的 探索建立高效、稳定的小分子干扰RNA(SiRNA)转染方案并建立优化的猪血管内皮细胞RNA干扰(RNAi)转染体系.方法 针对猪α1,3-半乳糖苷转移酶(α1,3-GT)基因合成数对SiRNA分子,运用不同转染体系(DOSPA、RiboJuice及Lipofectamine 2000)转染永生化猪血管内皮细胞系(PED).分别应用流式细胞术、台盼蓝拒染试验及乳酸脱氢酶释放试验评价干扰α1,3-GT作用下PED的α1,3-半乳糖残基(α-Gal)表达情况以及SiRNA-脂质体转染对PED生长的影响.结果 PED能有效发生特异性RNA干扰现象,且呈明显的剂量依赖性特征.SiRNA-1与脂质体RiboJuice在12 nmol/L∶6 μl时,干扰效果最佳(67.3%～89.5%),整体量效优于DOSPA及Lipofectamine 2000转染体系.靶细胞转染SiRNA-1后48 h时的α-Gal相对表达水平为10.5%,而SiRNA-2转染组则未见明显干扰现象.脂质体转染体系在转染后6～12 h对靶细胞生长稍有影响,24 h后细胞活性逐渐恢复.结论 猪血管内皮细胞存在RNA干扰机制,RiboJuice转染体系是一种高效、低毒的SiRNA转染方式,为研究RNAi在抑制异种排斥反应中的应用奠定了基础.     

兔主动脉内皮细胞制备方法的优化

目的为构建骨组织工程血管化提供优质种子细胞。方法采用血管内膜外翻和胶原酶消化法分离培养兔主动脉内皮细胞并传代;采用倒置显微镜、透射电镜观察和免疫荧光法鉴定。结果培养的血管内皮细胞在第3~5天为对数生长期,倒置显微镜下可见内皮细胞呈紧密排列、短梭多角形的"鹅卵石"形态;透射电镜可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体;经免疫荧光法鉴定证明该细胞CD31抗原阳性。结论采用血管内膜外翻等方法制备的兔血管内皮细胞的成活率高,且纯度高、数量多、具有良好的生物学活性。该法可为骨组织工程血管化的研究提供种子细胞。     

枸橼酸西地那非诱导小鼠主动脉内皮细胞迁移和蛋白水解酶分泌

在血管生成阶段，血管内皮细胞释放蛋白水解酶降解细胞外基质，致使细胞迁移。枸橼酸西地那非通过抑制PDE5激活单磷酸鸟核苷途径。Kim等进行了一项研究，运用培养的小鼠主动脉内皮细胞检验枸橼酸西地那非诱导细胞迁移的机制。枸橼酸西地那非诱导了小鼠内皮细胞细胞的迁移和蛋白水解酶的分泌。枸橼酸西地那非诱导了MMP-2和MMP-9的分泌，且能被NF-（kappa）B抑制因子抑制。     

抗肝癌血管内皮细胞的单克隆抗体的制备和鉴定

目的　研究制备抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体,并进行初步的鉴定。方法　单克隆抗体制备：将制备好的抗原、免疫动物,行ＰＥＧ 细胞融合、免疫组织化学和ＥＬＩＳＡ抗体筛选,进行细胞克隆。抗体的生产及纯化;组织学鉴定分析：亲和层析蛋白分离、ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳、免疫组织化学分析;抗体的体外细胞毒作用试验选用补体介导的细胞毒实验ＭＴＴ法。结果　以经肝癌细胞系培养上清诱导扩增的人胎脐静脉血管内皮细胞为抗原,制备并获得了抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体;组织学研究表明,抗体在肝癌组织的血管内皮细胞中有特异性,在体外对诱导扩增的血管内皮细胞有补体介导的细胞毒作用。结论　制备并获得抗肝癌区血管内皮细胞的单克隆抗体;抗体在体外具有细胞毒作用。     

人真皮微淋巴管内皮细胞的分离培养和鉴定

目的建立人真皮来源淋巴管内皮细胞(LECs)分离和培养的方法。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠从真皮组织分选CD34-/CD31 细胞。免疫细胞化学、免疫荧光及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测LECs特异标志的表达,噻唑蓝(MTT)比色试验测定多种与内皮细胞增殖相关的细胞因子和低氧条件对其增殖的影响。结果CD34-/CD31 细胞在单层细胞培养时形成内皮细胞典型的铺路石样外观,而在胶原凝胶三维培养时形成管状结构。CD34-/CD31 细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志,包括LYVE-1,VEGFR-3和Prox-1。RT- PCR显示Proxl和VEGFR-3 mRNA在CD34-/CD31 细胞中特异性表达。特异作用于淋巴管内皮细胞的VEGF-C对LECs的促增殖作用明显(P<0.01)。低氧条件和Ang2在体外未显示对LECs有促进增殖的作用。结论应用中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选可以成功分离获取人真皮LECs。     

去细胞猪主动脉瓣叶的获取和内皮细胞的种植

目的　探讨猪主动脉瓣叶去细胞后作为组织工程心脏瓣膜支架的可行性。　方法　经胰酶 - EDTA、表面活性剂和核酸酶处理 ,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分 ,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性 ,并在其表面种植新生牛主动脉内皮细胞 (BAECs) ;分别行大鼠皮下包埋实验。　结果　猪主动脉瓣叶中的细胞成分能完全去除 ,获得完整无细胞的纤维网状支架 ,断裂强度和断裂伸长率无明显变化 ;种植的 BAECs在去细胞瓣叶表面可形成一层连续的细胞层 ,其分泌前列环素 (PGI2 )的能力同直接种植在 2 4孔板中的比较 ,差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。　结论　猪主动脉瓣去细胞后获得的纤维支架可以用来构建组织工程瓣膜 ,适宜于血管内皮细胞的生长。     

内皮细胞流动培养模型的建立

目的 促进培养内皮细胞（ＥＣ）分化,增强ＥＣ对流体剪切力的抵抗。方法 利用改进的流室装置,通过精密蠕动泵提供剪切力,同时提供静态培养所需的其它条件,建立体外的ＥＣ流动培养模型,按流动培养增加剪切力的方式分为Ａ组、Ｂ组和Ｃ组,并筛选出最佳的流动培养模式。结果 ＥＣ在流动培养下生长良好,血管ＥＣ被拉长,其长轴方向与注场方向趋于一致。不同流动培养方式作用下,ＥＣ能适应剪切力递增式（Ａ组）和阶跃式（Ｂ组）     

永生化人肝窦内皮细胞株的形态和功能特性研究

目的 研究永生化人肝窦内皮细胞(LSEC)株的形态和功能特性,评价其作为体外研 究肝缺血再灌注损伤的细胞材料的可行性.方法 首先应用细胞免疫荧光染色、荧光显微镜以及流 式细胞术检测LSEC细胞株的纯度,透射和扫描电子显微镜技术观察细胞内的W-P小体和吞噬磁珠 的能力以及细胞表面窗孔结构.然后利用MTT法检测细胞的生长曲线,ELISA 法比较TNF-α刺激后人LSEC细胞株和原代LSEC黏附分子、纤溶活性分子和细胞因子的表达.最后采用TUNEL法比较两者对冷缺血再灌注损伤诱导凋亡的敏感性.结果 所建立的人LSEC 细胞株纯度达到95%以上.在形态上,人LSEC细胞株胞质内含有W-P小体,表面具有LSEC特异的窗孔结构.在功能上,人LSEC细胞株具有吞噬磁珠的能力和较强的增殖能力.在TNF-α刺激下,人LSEC细胞株和人原代 LSEC均剂量依赖性表达ELAM-1和ICAM-1,释放PAI-1、t-PA和u-PA;但人LSEC细胞株不产生IL-6 和IL-8.经冷缺血再灌注后,人LSEC细胞株的凋亡细胞百分率达到(38.4±6.7)%,明显高于人原代LBEC的(28.6±4.5)%和人脐静脉内皮细胞的(7.8±1.2)%.结论 已建立的人LSEC细胞株具有人原代LSEC的形态和主要功能特性,保留了对冷缺血再灌注损伤诱导凋亡的高度敏感性,因此可以作为体外研究肝脏缺血再灌注损伤机制的细胞材料.     

猪气管上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的 探索猪气管上皮细胞体外适宜的生长、增殖条件,以期为组织工程化气管内壁上皮化提供种子细胞.方法 无菌切取猪颈段气管,细菌蛋白酶消化.以明胶作为铺层,接种、培养.待细胞贴壁后,进行光镜观察、广谱角蛋白免疫组化检测、免疫荧光鉴定.结果 光镜观察可见细胞呈铺路石样生长.角蛋白检测和免疫荧光检测均呈阳性,而阴性对照组和空白对照组呈阴性.结论 以明胶作为铺层可以培养出活力较好、纯度高的气管上皮细胞.     

主动脉根部生理固定方法的建立

目的研究建立主动脉根部的生理固定方法，并进一步探讨生理固定方法对主动脉根部和主动脉瓣叶的影响。方法以有机玻璃为原料，研制各种型号的主动脉根部生理固定器。采集新鲜的猪心脏，修剪后保留升主动脉和二尖瓣前瓣及部分室间隔。将制备好的主动脉根部套入固定在生理固定器的接头上，在主动脉根部的流入和流出端同时加压扩张固定，此时的主动脉瓣叶在加压的根部内处于无压力差的自由漂浮状态，生理固定是为了保持主动脉根部和瓣叶的解剖形态。结果主动脉根部的生理固定方法保留了自然瓣膜的性状，生理固定的瓣叶比普通低压力固定瓣叶更加柔软和伸展，窦部的成形充分饱满，瓣叶的交界区无冗余组织。脉动流测试表明，80mmHg根部预扩张的猪主动脉瓣，其有效开口面积明显大于40mmHg（P〈0.05），而平均跨瓣压差则相对更低（P〈0.05）。生理固定的瓣叶在制备成瓣膜之后，功能更加接近于自然状态的主动脉瓣膜。结论主动脉根部的生理固定过程保持了原有瓣膜的自然形态和瓣叶的组织结构，为改善血流动力学提供了基础。     

大鼠淋巴管内皮细胞的原代培养及鉴定

恶性肿瘤淋巴结转移与血管内皮细胞生长因子（VEGF）-C／VEGFR-3信号调控通道的关系已在临床病理组织学上被证实，本实验旨在应用管内酶消化法进行大鼠的淋巴管内皮细胞的原代培养，观察它的形态和免疫组织化学特性。     

简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6-8d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80％的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。     

主动脉内气囊反搏泵的建立

主动脉内气囊反搏泵的建立曾侃１９８５年至１９９３年，我们曾用两种术式经股动脉建立主动脉内气囊反搏（ＩＡＢＰ）４８例，现总结如下，以求提高外科机械辅助循环抢救心衰的共识。临床资料本组中男２７例，女２１例。年龄７～６７岁，其中１３岁以下病儿４例，体重１８...     

裸鼠人肝癌血管内皮细胞的分离与鉴定

目的分离肝癌血管内皮细胞.方法采用CD31抗体交联免疫磁珠分选法,并加以优化,对裸小鼠原位人肝癌移植瘤进行血管内皮细胞分选;采用形态学观察、功能实验及RT-PCR等方法进行验证.结果从肝癌组织中分离的细胞呈现典型的内皮细胞形态特征,免疫组化证实内皮细胞标记分子CD31及VE-Cadherin表达阳性,超过95%的阳性分选细胞呈乙酰化低密度脂蛋白摄取实验阳性,RT-PCR示获得的细胞中内皮细胞标记分子CD31、VE-Cadherin及CD146的mRNA含量明显高于分离前.结论采用优化的免疫磁分选法可有效分离纯化肝癌组织中的血管内皮细胞,分离的内皮细胞可用于肝癌血管生成的相关研究.     

猪胸主动脉脱细胞血管基质的制备

目的 完全去除猪胸主动脉的细胞,制备成血管脱细胞基质。方法 采用胰酶和TritonX-100制备猪胸主动脉脱细胞基质。根据TritonX-100的浓度将实验分为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％等6组。标本进行大体、光镜、电镜观察,并进行DNA含量的测定。结果0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％浓度的TritonX-100能分别在(104.0±3.8)h、(89.6±3.4)h、(74.4±3.9)h、(72.8±2.5)h、(72.0±0.0)h、(72.0±0.0)h内完全脱除猪胸主动脉的细胞,同时较好地保持了胶原纤维和弹性纤维的原有排列和分布。TritonX-100的脱细胞作用呈浓度依赖性,最佳脱细胞浓度为0.5％。结论 本方法可以成功制备大血管脱细胞基质,可以进一步用于组织工程带瓣管道或瓣膜的研究。     

冷冻速率对猪主动脉冷冻保存效果的影响

目的比较不同冷冻速率对大口径猪动脉功能及内皮的影响.方法 16头乳猪切取胸主动脉,每根主动脉分3段,作为对照、-1℃/min冷冻和-5℃/min冷冻处理.分别测定内皮细胞死亡率和血管活性药物引起的收缩、舒张程度.结果 -5℃/min冷冻组内皮细胞死亡率明显高于-1℃/min冷冻组和对照组,P＜0.01.冷冻组由去甲肾上腺素引起的收缩张力值明显低于未冷冻对照组P＜0.01.-5℃/min组明显低于-1℃/min组,P＜0.01.冷冻组由乙酰胆碱引起的张力下降绝对值与对照组差异无显著性,P＞0.05;舒张程度与对照组有明显差异,P＜0.01.-5℃/min组舒张程度明显低于-1℃/min组,P＜0.01.内皮细胞死亡率与乙酰胆碱舒张作用呈负相关,P＜0.05.结论冷冻对猪主动脉的结构和功能造成损伤.慢速冷冻对内皮细胞破坏小,对血管平滑肌的收缩和内皮依赖性舒张的损害小.