直接提取病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎试验

为研究奶牛隐性乳房炎主要致病菌的快速检测方法,本试验选取山西省太原市小店区某规模化奶牛场39头隐性乳房炎患牛,利用Chelex-100方法直接提取奶样金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及停乳链球菌DNA进行检测。结果表明,利用Chelex-100方法直接提取奶样中病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎,具有简单、快速、经济、无污染、PCR敏感性高等优点,对PCR快速检测奶牛隐性乳房炎具有重要意义。     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌.其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103 cfu/mL.     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

双重PCR检测奶牛隐性乳房炎大肠杆菌与无乳链球菌方法的建立及应用

为快速检测奶牛隐性乳房炎主要致病菌大肠杆菌和无乳链球菌,分别针对2种致病菌16S-23S rRNA和16S rRNA基因设计2对特异性引物,优化并确立双重PCR反应体系。特异性检测表明,对其他对照菌株未扩增出目的条带;敏感性试验表明,该双重PCR对大肠杆菌、无乳链球菌的最小检测浓度分别为10~2、10~3cfu/mL。同时采用双重PCR与细菌学检查法对送检的96份奶样进行检测,结果双重PCR检出63份大肠杆菌阳性、54份链球菌阳性;细菌学方法检出29份大肠杆菌阳性、37份链球菌阳性。说明本研究建立的双重PCR方法敏感、快速,可用于检测大肠杆菌和无乳链球菌引起的奶牛隐性乳房炎。     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103cfu/mL。     

Chelex-100法直接提取乳样中奶牛乳房炎主要致病菌DNA方法的建立

为建立一种直接从乳样中快速提取细菌DNA的方法,试验通过人工制备8个倍比稀释细菌的乳样,检测了Chelex-100法提取3种奶牛乳房炎主要致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌)DNA进行PCR扩增的敏感性,并与苯酚—氯仿法进行了比较分析。结果显示,以Chelex-100法提取乳样中细菌DNA进行PCR扩增具有较高的敏感性,所检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的最小浓度分别为10³、10²、10² CFU/mL;而使用苯酚—氯仿法提取乳样中各细菌DNA的PCR敏感性均为10⁴ CFU/mL。综上所述,Chelex-100法提取乳样细菌DNA的PCR敏感性可以满足临床检测奶牛乳房炎的需要,显现了简单快速、经济、无污染的优点,为从乳样中直接提取细菌DNA提供了新的思路,对PCR快速检测乳房炎致病菌具有重要意义。     

奶牛乳房炎主要致病菌16S rDNA基因芯片检测方法的建立

本研究建立了快速检测奶牛乳房炎主要致病茵的基因芯片方法,试验以奶牛乳房炎4种主要致病菌的16SrDNA基因作为基因芯片检测的靶片段,设计和筛选通用性引物和特异性探针,对通用引物进行荧光标记、PCR扩增、芯片杂交和信号扫描分析,根据杂交信号强度和聚类分析结果,判定奶牛乳房炎感染的致病菌种类。实验结果显示：以16SrDNA为靶基因检测奶牛乳房炎主要致病菌（无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌）的基因芯片方法,可以快速、特异、准确地对这4种试验菌株进行检测和鉴定。该检测方法的建立将为流行病学调查、食品卫生监督、乳房炎的防控等提供快速、有效的检测方法,具有良好的市场应用前景。     

PCR诊断技术用于奶牛乳房炎病原菌快速检测的研究进展

奶牛乳房炎是一种严重影响奶牛业发展的常见多发病,不仅给乳品业造成巨大的经济损失,而且还影响乳品质量,危及人类健康。目前,对于奶牛乳房炎的治疗大部分奶牛场基本都是在不明确病原菌的情况下滥用抗生素,造成病原菌耐药性增加,治疗效果下降。为了有效治疗奶牛乳房炎,对奶牛乳房炎病原菌的早期快速诊断至关重要。由于传统的乳房炎病原菌的检测方法存在操作繁琐、耗时长、灵敏度低及无法检测抗生素乳样中病原菌等缺陷,因此,临床上急需一种快速、灵敏、简便的检测方法。作者对目前用于奶牛乳房炎病原菌诊断的普通PCR法、多重PCR法、实时荧光定量PCR法、巢氏PCR诊断法以及PCR检测试剂盒等进行了综述,并分析了这些方法的优缺点,同时对未来奶牛乳房炎病原菌诊断的研究方向和前景进行了展望,以期为进一步开发快速、特异、敏感的奶牛乳房炎病原菌诊断技术提供理论参考。     

细菌通用引物在奶牛乳房炎病原菌检测中的作用研究

为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7 种标准菌株,370 bp处均可得到清晰的电泳条带;通用引物PCR 可检出250 ng/L的金黄色葡萄球菌标准菌株DNA;对患有奶牛乳房炎的奶样进行扩增,370 bp处也得到了清晰的电泳条带。建立在16S rRNA基础上的通用引物在奶牛乳房炎的检测中,初步显示具有特异、快速等优点,为进一步判断细菌的种类奠定了基础。     

奶牛乳房炎源大肠杆菌的分离鉴定

奶牛乳房炎是严重影响我国奶牛业主要的发展疾病之一。本文通过对采集患乳房炎的牛奶进行细菌学分离鉴定、形态学观察、生化特性试验等方法,引起奶牛乳房炎的病原菌为大肠杆菌,通过致病性试验验证其分离大肠杆菌的致病性,结果显示,分离的大肠杆菌为致病性大肠杆菌。药敏试验结果显示,分离的奶牛乳房炎源大肠杆菌对氟苯尼考、头孢曲松、头孢他啶、恩诺沙星4种药物高度敏感;对新霉素、庆大霉素、多西环素、阿莫西林、阿米卡星、青霉素、卡那霉素7种药物耐药。     

TaqMan探针-荧光定量PCR筛查奶牛乳房炎主要致病菌的研究

为研究奶牛场生鲜乳中的相关致病菌,以江苏省奶牛生产性能测定中心为平台对江苏南通、盐城和宿迁3个地区的3家奶牛场2019年5-10月份DHI数据进行分析,将奶牛SCC作为参考预警值。依托奶牛疾病检测联合创新实验室,通过牛奶致病菌快速检测荧光定量PCR法,初步了解其中主要致病菌种,再分离、培养、鉴定奶样中主要的致病菌,结合药敏试验给出具体治疗建议。结果表明从试验奶样分离出的主要致病菌为大肠杆菌、黏质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌、乳房链球菌、无乳链球菌等,通过药敏试验可知喹诺酮类和头孢菌素类抗菌药物对检测出的几种主要致病菌引起的奶牛乳房炎具有较好抑制作用,便于牧场及时治疗患病奶牛。该结果说明体细胞数(SCC)作为DHI检测的一项重要指标,对奶牛乳房炎起到第一预警作用;快速检测荧光定量PCR法可快速了解生鲜乳中含有的主要致病菌,从而推测导致奶牛乳房炎的致病菌,便于分离、培养、鉴定主要致病菌;TaqMan探针-荧光定量PCR可简化测定流程、缩短时间、明确主要致病菌,可提高牧场生产效率,为牧场的生产管理提供便捷。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

奶牛乳房炎3种主要病原多重PCR检测方法的建立

根据GenBank收录的序列,针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌在16S rRNA与23S rRNA之间的序列设计2对引物,扩增的片段长度分别为420 bp和270 bp;酵母样真菌参照念珠菌和隐球菌的18S rRNA发表的序列设计引物,扩增的片段长度为730 bp左右。建立了用于检测奶牛乳房炎的多重PCR检测方法,并对PCR扩增的特异性和敏感性进行了优化。运用建立的多重PCR方法对从无锡市采集的34份样品进行病原菌检测,结果表明,本试验建立的多重PCR检测方法具有高效、快速和灵敏的特点,为进一步防控乳房炎奠定了基础。     

应用维生素E防止奶牛乳房炎

奶牛乳房炎长期以来是奶牛的一种主要病症[1]。要提高牛奶的质量和饲养户的经济收入，必须改进对奶牛乳房炎的控制方法，因为乳房炎并不是由单一的病原菌所引起，而是由包括多种微生物（主要是细菌）直接感染乳腺的结果，所以依靠单纯的控制乳房炎的方法是非常困难，而且难以奏     

奶牛乳房炎检测技术与牛奶质量关系的研究进展

牛奶质量与诸多因素相关,其中奶牛疾病是影响牛奶质量的根源。奶牛乳房炎是一种奶牛常见的疾病,与牛奶质量、产量有密切的关系。目前奶牛乳房炎防治在中国刚刚起步,因此奶牛乳房炎检测技术对奶牛疾病控制、牛奶质量、畜牧业发展和人们身体健康具有重要意义。     

奶牛乳房炎病原检测技术研究进展

奶牛乳房炎是危害奶牛业最重要的疾病之一,不仅给奶牛业造成了巨大的经济损失,而且其某些病原体可引起人类感染。引起奶牛乳房炎的病原多达150种,及时、准确的诊断乳房炎并检测出致病菌,对奶牛乳房炎的综合防治有着重要意义。目前,检测乳房炎病原的方法主要有细菌分离鉴定法、免疫学检测法、基因芯片和PCR检测技术等。本文就奶牛乳房炎病原检测技术进行系统阐述,旨在为奶牛乳房炎的综合防治提供参考。     

牛乳中乳房链球菌PCR检测方法的建立

奶牛乳房炎是危害奶牛业最常见的疾病之一,对奶牛业造成了严重的经济损失。引起奶牛乳房炎的病原菌较多,其中乳房链球菌是常见的致病菌之一。为快速准确地检测样品中的该菌,参照GenBank公布的乳房链球菌pauA基因序列设计引物,建立了乳房链球菌的PCR检测方法。对460份临床奶样进行检测,传统细菌分离方法共检出11份(2.39%)阳性奶样;PCR方法共检出40份(8.70%)阳性奶样,2种方法的吻合率为93.7%。结果显示,建立的乳房链球菌PCR检测法敏感性高,特异性强,适用于临床检测。     

奶牛隐性乳房炎简易诊断方法的探讨

隐性乳房炎是奶牛常发病之一,不仅使牛奶质量下降、保存期短、而且严重影响奶牛的生产力。因此对隐性乳房炎的及时诊断与防治是奶牛生产上的重大课题之一。目前对隐性乳房炎的检测方法很多,如检查牛体细胞,这种方法虽然准确率高,但主要应用于实验室,不易在广大农村推广。最近几年应用乳房炎诊断液进行牛旁快速诊断,这种方法诊断迅速,但生     

山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在了解山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的污染状况及耐药情况。选择山东省3个地区的规模化奶牛场共采集227份牛奶样品,采用细菌学方法对大肠杆菌进行分离鉴定,用微量肉汤稀释法检测分离菌对11种常规抗菌药物的敏感性,采用PCR方法对常见的13种耐药基因、8种毒力基因和Ⅰ类整合子基因盒结构进行分析。结果显示,从227份牛奶样品中共分离出71株大肠杆菌;大肠杆菌对1种及1种以上抗菌药耐药的菌株达到77.5%,多重耐药率为15.5%,其中对多黏菌素耐药率为52.2%,对阿莫西林-克拉维酸耐药率为39.4%,而所有菌株均对新霉素表现为敏感。PCR检测耐药基因、毒力基因和Ⅰ类整合子结果显示,β-内酰胺类耐药基因中blaTEM基因携带率为100%,其中全部为blaTEM-1基因,blaCTX-M基因携带率为32.4%,其中主要为blaCTX-M-15基因,没有检测到blaSHV、blaOXA基因;多黏菌素的耐药基因mcr-1携带率为29.6%;喹诺酮类耐药基因中aac(6’)-Ⅰb-cr基因携带率为29.6%,qnrB基因携带率为20.8%,没有检测到qnrA和qnrC耐药基因;对8种毒力基因检测分析结果显示,仅Hly毒力基因没有被检出,Ecs3703、Irp2基因的检出率较高,分别为90.1%和63.4%,71株大肠杆菌中共有11株携带Ⅰ类整合子,检出率为15.5%,11株大肠杆菌携带6种耐药基因盒结构,最主要的耐药基因盒排列为dfr17-aadA5。本研究结果表明,山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的耐药现象严重,携带毒力基因Ecs3703、Irp2的大肠杆菌可能是引起奶牛乳房炎的致病菌,Ⅰ类整合子的检测在细菌耐药性与基因携带率方面发挥着关键作用,可为临床预防和治疗奶牛乳房炎大肠杆菌病提供理论依据。     

如何预防奶牛乳房炎

奶牛乳房炎是奶牛养殖过程中的一种常见的多发性疾病。奶牛乳房炎的发生，对牛奶的产量和质量将会造成严重的影响，并能延长产后发情和妊娠时间，甚至使病牛失去生产性能，给我国奶牛业的发展造成了极其严重的经济损失。引起乳房炎的主要因素是微生物感染，如大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌等：其次是乳房创伤所引起。奶牛乳房炎，预防是关键。