一株水产用益生枯草芽孢杆菌液体发酵初步研究

通过正交实验、单因素实验和100L发酵罐中试确定了枯草芽孢杆菌HJ02工业生产用的优化液体培养基和发酵工艺条件。最佳培养基配方为:葡萄糖10g/L、玉米粉8g/L、豆粕粉25g/L、硫酸锰30.8mg/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钠0.52g/L、磷酸氢二钠2.33g/L;最优发酵工艺条件:培养温度30℃,初始pH值7.0,最佳接种的菌龄是18h。     

一株广温性大菱鲆肠道益生菌的筛选与鉴定

从健康的大菱鲆肠道内分离细菌,以大菱鲆致病菌鲨鱼弧菌Vibrio archariae和大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi为指示菌,根据拮抗作用原则,分离得到一株菌TYTG-1.根据菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.从养殖大菱鲆肠道中分离获得枯草芽孢杆茵在国内属首次报道.该株茵在4～42℃均能生长,属广温性.经过28d的投喂添加浓度为107和109CFU/g枯草芽孢杆菌的饲料,大菱鲆生长正常,未产生不良反应.该株枯草芽孢杆茵对引起大菱鲆腹水病和肠炎病的两株致病弧茵具有良好的拮抗作用,其具有较大潜力作为肠道益生菌应用于大菱鲆的养殖.     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

1株水产用益生枯草芽孢杆菌液体发酵初步研究

通过正交试验、单因素试验和100L发酵罐中试确定了枯草芽孢杆菌HJ02工业生产用的优化液体培养基和发酵工艺条件。最佳培养基配方为：葡萄糖10g/L、玉米粉8g／L、豆粕粉25g／L、硫酸锰30．8mg／L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钠0．52g/L、磷酸氢二钠2．33g/L;最优发酵工艺条件：培养温度30℃,初始pH值7．0,最佳接种的菌龄是18小时。     

一株功能益生菌的简易发酵及其在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生物絮团养殖中的应用

对一株有脱氮作用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)进行简易发酵,以对虾饲料及赤砂糖为培养基,通过正交实验及发酵条件优化,在对虾饲料3 g/L、赤砂糖6g/L、接种量1×108 CFU/ml、发酵温度31℃、装液量40％条件下,发酵24 h可获得活菌数为1.16× 1010 CFU/ml的发酵产物.使用发酵得到的巨大芽孢杆菌进行凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生物絮团养殖实验.结果显示,添加芽孢杆菌和赤砂糖的增强絮团组的絮团形成速度较添加赤砂糖的絮团组及传统养殖的对照组明显提升(P＜0.05),整体上增强絮团组的亚硝酸氮水平与絮团组和对照组差异显著(P＜0.05).养殖结束时,添加巨大芽孢杆菌组的对虾体长、体重水平均显著高于另2组.本研究建立了一种简单可行的功能益生菌发酵方式,并验证添加功能益生菌可提高生物絮团技术在对虾养殖中的效果.     

一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽孢杆菌

对实验室暂养发病的刺参(Apostichopus japonicus)进行了微生物学分析,从所有患病个体的病灶组织分离得到了1株具绝对优势的细菌,经回接感染试验证实它对刺参具有较强的致病性.通过形态学、生理生化指标测定和16SrDNA序列分析,该菌被初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).蜡样芽孢杆菌通常被视为益生菌,广泛应用于畜禽养殖,水产养殖上也有使用.鉴于蜡样芽孢杆菌能导致刺参"腐皮综合征"的发生,建议在刺参养殖环境中应慎用该菌制剂.     

枯草芽孢杆菌B2的生长及其对仿刺参的益生特性

从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离得到一株芽孢杆菌菌株B2,经16SrDNA鉴定以及形态学分析确定其为枯草芽孢杆菌。该菌株生长适宜温度为15~35℃,适宜pH为6~8,适宜盐度为30~50。电镜观察发现,枯草芽孢杆菌B2周围有明显可见的芽孢。枯草芽孢杆菌B2可产淀粉酶和蛋白酶,但不具有产脂肪酶的能力。将枯草芽孢杆菌B2按照仿刺参体质量的0.1%、0.2%和0.3%配成不同密度的菌液,添加至饲料中,投喂7d后发现,该菌株可有效提高仿刺参肠道内的消化酶以及体腔液中多种非特异性免疫酶的活性。结果表明,枯草芽孢杆菌B2可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参饲料中。     

一株水产用益生枯草芽孢杆菌液体发酵初步研究

为解决工业化生产中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数量低、成本高的问题,通过正交试验、单因素试验和100 L发酵罐中试,确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJ02工业生产用的优化液体培养基和发酵工艺条件。最佳培养基配方为:葡萄糖10 g/L、玉米粉8 g/L、豆粕粉25 g/L、硫酸锰30.8 mg/L、硫酸镁5 g/L、磷酸二氢钠0.52 g/L、磷酸氢二钠2.33 g/L;最优发酵工艺条件为:培养温度30℃,初始pH 7.0;最佳接种菌龄是18 h。优化后培养基成本降低了50%以上,细菌浓度达到了7.19×109个/mL。     

野生与养殖刺参营养成分的比较分析

分别对野生和养殖的刺参（Apostichopus japonicus）体壁中营养成分,包括灰分、盐分、蛋白质、粘多糖、胶原蛋白、皂苷、氨基酸组成及11种无机元素进行了比较分析。结果显示,野生和养殖刺参的胶原蛋白质量分数（以干基计）为39.43%和40.37%,差异不显著（P〉0.05）;盐分、粘多糖及皂苷质量分数分别为18.47%、15.40%,10.19%、9.27%和0.81%、0.62%,差异显著（P〈0.05）;灰分、粗蛋白质质量分数分别为25.73%、20.74%和58.80%、62.21%,差异极显著（P〈0.01）。氨基酸组成中必需氨基酸总量分别为21.16%和20.28%,差异显著（P〈0.05）;鲜味氨基酸、药效氨基酸总量分别为30.86%、28.00%和33.66%、30.39%,差异均极显著（P〈0.01）。矿物元素含量丰富,野生刺参的微量元素比例要略优于养殖刺参,铅（Pb）、汞（Hg）和镉（Cd）等重金属含量均符合相关食品卫生标准限量。综合分析认为,野生和养殖刺参均有较高的营养价值,富含胶原蛋白、粘多糖等生物活性物质及人体所需的矿物元素,鲜味氨基酸和药效氨基酸含量丰富。     

注射一株灭活气单胞菌苗对刺参部分免疫因子的影响

从患有"腐皮综合征"的刺参(Apostichopus japonicas Liao)病灶处分离出l株优势菌株,经形态学、生理生化分析以及16s rDNA分子生物学方法鉴定其为气单胞菌属(Aeromonas)的1个种;人工感染试验证明,该菌株对刺参有一定毒力.将其制备成甲醛火活菌苗后对健康刺参进行体腔注射,测定灭活气单胞菌苗对刺参部分免疫指标的影响,同时将生理盐水注射组作为对照.结果表明,注射菌苗浓度3.9×108CFU/mL,组刺参血清中溶菌酶活力在注射后6 h达到峰值,而4.7×107CFU/mL注射组的活力在注射后24 h达到最高值;实验组的溶菌酶活力显著高于对照组(P<0.05).在3.9×108CFU/mL组中,碱性磷酸酶活力于48 h达到最高值;而4.7×107CFU/mL,组在96 h达到最高值,实验组的碱性磷酸酶活力显著高于对照组(P<0.05).相比之下,注射菌苗对血清的超氧化物歧化酶活力影响却不显著.总体上,该菌苗在一定程度上可以刺激刺参机体产生强的免疫应激反应.注射高浓度菌苗时,溶菌酶、碱性磷酸酶活力达峰所用时间较短而且显著,但其酶活力升高持续时间较短.[中国水产科学,2009,16(1):82-88]     

黄芪多糖微胶囊制备及对刺参抗病力的影响

以黄芪多糖为芯材,海藻酸钠为壁材,采用苯酚-硫酸比色法,测得微胶囊的载药量为108mg/g;包埋率为85.7%。以初始体重为30.00±1.00g的刺参为研究对象,在室内循环水系统中进行连续35d的饲喂实验;以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加3%空白微胶囊和1%、3%和5%黄芪多糖微胶囊(实验组1～4);饲喂实验结束后,通过注射刺参腐皮综合征致病菌灿烂弧菌Vibrio splendidus进行刺参攻毒实验。攻毒后14d内,实验组3和实验组4的累计发病率分别为13.33%和12.22%,均显著低于对照组、实验组1和实验组2(分别为40.00%、37.78%和32.22%)(P<0.05);实验组3和实验组4的累计发病率差异不显著(P>0.05);而实验组2累计发病率也显著低于对照组(P<0.05),但是对照组与实验组1、实验组1与实验组2之间累计发病率差异均不显著(P>0.05)。由此可知,添加3%和5%黄芪多糖微胶囊可以提高刺参的非特异性免疫力和抗病力,对刺参的免疫保护率可分别达到66.67%和69.44%。     

刺参养殖池塘一株贝莱斯芽孢杆菌的分离及其生理特性

2014年5月,在东营的刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘环境中对水样和底泥样品进行了细菌分离和益生菌的筛选,共获得66株可培养细菌。以刺参"腐皮综合征"主要致病菌为指示菌进行拮抗作用实验,使用选择培养基对菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力进行测定,筛选获得一株潜在益生菌株——DY-6,并进行了生理生化实验、16S r DNA基因序列分析、菌株生长特性及其对刺参的安全性研究。结果表明,DY-6对其指示菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)均有良好的抑制作用,抑菌圈直径分别达到24 mm、22 mm、27 mm和37 mm,对淀粉和蛋白培养基的水解直径分别为28 mm和20 mm。利用该菌对刺参进行高浓度胁迫实验测试其安全性,实验期间浸浴组和投喂组刺参状态良好,没有发病和死亡现象。利用细菌生理生化和16S r DNA基因序列分析表明,DY-6与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis CP015911)的相似性为99%。因此,初步鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。同时,将该菌株与商品化微生态制剂产品中分离的4株益生菌进行了比较,DY-6在温度20~35℃、盐度0~35范围内生长较快,优于上述4株菌,4 h进入对数生长期,10 h达到生长高峰。筛选的贝莱斯芽孢杆菌具有良好的抑菌能力,生长速度快,并且具有广温广盐的优点,不仅能够降低疾病发生率,还可更好地适应黄河口地区夏季水温偏高、盐度波动大的特点,由此具有良好的益生菌商业化开发潜力。     

Dietary supplement of fructooligosaccharides and Bacillus subtilis enhances the growth rate and disease resistance of the sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka)

The effects of two dietary supplements, entrapped fructooligosaccharide (FOS) and microencapsulated Bacillus subtilis, on the growth and disease resistance of the sea cucumber Apostichopus japonicus were investigated. Sea cucumbers (a total of 810 animals, with initial weight of 3.72 ± 0.16 g each) were fed with basal diet only or basal diet supplemented with three different doses of B. subtilis (0.2, 0.4 and 0.8%), three different doses of FOS (0.4, 0.8 and 1.6%), 0.2% B. subtilis plus 0.4% or 0.8% FOS. Growth and lysozyme activity were measured after 50 days feeding. The results showed that dietary 0.2% and 0.4% B. subtilis alone or 0.2% B. subtilis plus 0.8% FOS significantly increased the specific growth rate (SGR) of sea cucumbers compared with control (P < 0.05). The addition of B. subtilis with or without FOS had no significant effect on lysozyme activity. The animals were also challenged with Vibrio splendidus to assess the level of disease resistance provided by the two dietary supplements. Sea cucumbers fed with 0.8% B. subtilis or 0.2% B. subtilis plus 0.8% FOS exhibited the highest survival (P > 0.05). Under these experimental conditions, dietary B. subtilis and FOS had no synergistic effect on enhancing SGR and disease resistance of sea cucumber.     

Effects of a probiotic mixture (Bacillus subtilis YB‐1 and Bacillus cereus YB‐2) on disease resistance and non‐specific immunity of sea cucumber,Apostichopus japonicus (Selenka)

The effect of a commercially available compound probiotics product containing Bacillus subtilis YB‐1 (50%) and Bacillus cereus YB‐2 (50%) fed to sea cucumbers, Apostichopus japonicus (Selenka) on challenge infections and non‐specific immune responses was assessed. Sea cucumbers (were randomly allocated into nine aquariums at a density of 30 sea cucumbers per tank and triplicate groups) were fed diets containing 0 (control), 10⁷ and 10¹⁰ cfu (g diet)^?1 of the probiotics mixture for 32 days. The growth factors and immunological parameters were measured. In addition, the effects on resistance against Vibrio alginolyticus infection were also evaluated. The results indicate that all the immunological parameters (phagocytic activity, superoxide anion production, lysozyme activity, catalase activity and phenoloxidase activity) measured and the growth rate of sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture were significantly (P < 0.05) improved than control groups at 16 and 32 days. After challenging, the cumulative mortality for the control was 100%, whereas the cumulative mortality for sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture was 47% (P < 0.05). Although the total autochthonous intestinal heterotrophic bacterial counts were not affected by dietary treatment (P > 0.05), Bacillus sp. levels were significantly elevated in sea cucumbers fed the probiotics mixture (P < 0.05). These results confirmed that administration of the probiotics mixture in the diet stimulated non‐specific immune responses and enhanced the growth performance of sea cucumbers, and was effective in controlling infections caused by V. alginolyticus.     

Synergy of microcapsule polysaccharides and Bacillus subtilis on the growth, immunity and resistance of sea cucumber Apostichopus japonicus against Vibrio splendidus infection

A 4-week feeding trial was conducted to determine the effects of different dietary supplements on the growth, immunity and resistance of sea cucumber Apostichopus japonicus against Vibrio splendidus infection. The control group was supplied with blank microcapsules, and Astragalus polysaccharide (APS) microcapsules, tuckahoe polysaccharide (TPS) microcapsules, (APS + TPS) microcapsules, (APS + TPS) microcapsules + Bacillus subtilis, were tested for effects. Coelomic fluid was collected at 7-day intervals to test activities of lysozyme (LSZ), superoxide dismutase (SOD), alkaline phosphatase (AKP), and complement 3 (C3) content. After the feeding trial, the specific growth rate of sea cucumbers fed a diet supplemented with (APS + TPS) microcapsules + B. subtilis was significantly increased (P < 0.05); activities of LSZ, SOD, AKP and C3 content were significantly higher than in other groups (P < 0.05). The challenge test showed that the cumulative mortality of sea cucumbers fed a diet supplemented with (APS + TPS) microcapsules + B. subtilis reduced significantly (P < 0.05). In conclusion, dietary combinations of (APS + TPS) microcapsules + B. subtilis has a potential for use in diet formulations for sea cucumbers to significantly increase growth, immunity and disease resistance against V. splendidus infection.     

枯草芽孢杆菌固态发酵工艺研究

对枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的固态发酵工艺进行了研究,包括碳源、氮源、含水量、初始pH、接种时间、接种量等影响因素,并通过单因子试验和正交试验优化,确定了枯草芽孢杆菌的固态发酵工艺为：（1）培养基：麸皮19．5g,稻谷壳0．5g,豆粕1．0g,水22mL;（2）发酵条件：初始pH为7．0、接种时间20h,接种量为0．9mL。照此工艺发酵,枯草芽孢杆菌的活茵数高达435亿个／g。     

芽孢杆菌与光合细菌协同作用对养殖刺参的影响

为研究芽孢杆菌和光合细菌协同作用对刺参养殖水质及其生长、消化和免疫的影响,测定了水体化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)和亚硝酸盐氮(NO2--N)24 h的变化量、肠道蛋白酶和淀粉酶的活性以及体腔液超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LSZ)的活力。结果显示,混合菌投喂组优于单一菌投喂组。在芽孢杆菌和光合细菌投喂浓度以1.86×105和1.75×104CFU/mL搭配时,该实验组协同作用效果最优,水体COD、NH4+-N和NO2--N含量均显著低于对照组(P<0.05);刺参特定生长率最大(0.76%/d),较对照组提高56.8%,成活率亦最高(97.8%);蛋白酶和淀粉酶活性最高(96.72和98.72 U/mg prot),较对照组显著提高149%和44.82%;体腔液SOD活力最高(65.16 U/mL)。而两种菌对刺参AKP和LSZ活力的影响较小。研究表明,芽孢杆菌和光合细菌搭配合理效果更佳,能够有效改善养殖环境,提高刺参消化酶活性和免疫力,促进刺参生长。