斑马鱼VEGF基因的siRNA表达载体构建、有效序列筛选及其对基因表达的干预性研究

为探索小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）表达质粒在研究斑马鱼血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因调控网络中的应用,构建了4个以斑马鱼VEGF基因为靶点的siRNA表达载体pSI—VEGF、pS2-VEGF、pS3-VEGF及pS4-VEGF。通过显微注射的方法将载体导入1-2细胞期斑马鱼体内,于胚胎发育的48h采用RT-PCR的方法检测VEGF基因的表达量,研究不同干扰序列对VEGF基因表达的干涉作用。结果显示,成功地构建了siRNA表达载体。针对不同位点的寡核苷酸序列抑制VEGF基因表达的效率有显著差异,其中注射了ps1-VEGF的胚胎出现了心包膜水肿、血流速度减慢、循环红细胞堆积等症状,同时肠下静脉、节间血管以及其它血管出现不同程度的发育缺陷。实验结果说明,pS1-VEGF可引起斑马鱼胚胎血管发育缺陷。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的:构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法:荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果:在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论:成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

利用小干扰RNA抑制小管间质性肾炎抗原相关蛋白的表达

目的：设计并构建TIN-ag-RP基因的小干扰RNA（siRNA）,检测其对小管间质性肾炎抗原相关蛋白（TIN—ag-RP）表达的干扰效果。方法：设计2条针对TIN-ag-RP基因的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer2．1-U6 neo上;经酶切和测序证明构建成功后,将重组质粒和带FLAG标签的TIN-ag-RP基因共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验siRNA的干扰效果。结果：获得了2个TIN-og-RP基因siRNA真核表达载体,均能有效抑制TIN-ag-RP的表达,其中一条的抑制效率诂90％以上。结论：构肆的TIN-ag-RP某因的siRNA能有效抑制TIN-ag-RP的表达。     

小环载体介导的siRNA 稳定抑制乙肝病毒的复制和表达

【目的】尝试构建表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的小环载体,并初步鉴定其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及其基因表达的抑制作用。【方法】设计并合成靶向HBV S区的siRNA,将其克隆到小环载体pMC.BESPX-MCS2上,测序正确后将重组体pMC-H1-siHBS-U6转化入感受态E.coliZYCY10P3S2T,然后在培养基中加入L-阿拉伯糖,诱导其降解细菌骨架,获取只含有目的基因表达盒的小环RNA干扰载体pmc-H1-siHBS-U6。将小环RNA干扰载体与HBV真核表达质粒pHBV1.3共转染Huh-7细胞,分别在转染后1-7天,ELISA法检测Huh-7细胞上清中的HBsAg、HBeAg,并且通过Real-time RT-PCR法分析干扰RNA对HBV DNA及mRNA的抑制效果。【结果】成功构建了靶向HBV S基因的siRNA小环表达载体pmc-H1-siHBS-U6。该载体能显著抑制Huh-7细胞HBsAg和HBeAg分泌,并且其抑制效果能够维持2-3周时间。Real-time PCR证实HBV的DNA与mRNA水平分别降低了71%和80%,而对照siRNA及空载体则无此作用。【结论】成功构建了靶向HBV的小环RNA干扰载体,并且其能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达与复制,该研究不仅对探索HBV的基因治疗提供了重要线索,而且为RNA干扰的应用提供了新的运载体系。     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。方法设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamHI及Hindm酶切位点分别克隆入pSilencer4．1-CMVhygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染入A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制。结果测序鉴定表明4个MEKK3siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4．1-MEKK3siRNA2的抑制率达84％;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4．1-MEKK3siRNA2可稳定沉默MEKK3mRNA的表达,有效率达83％。结论成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。     

STAT3小干扰RNA的构建及对缺氧复氧人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:构建信号转导与转录因子3(STAT3)小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对缺氧复氧后人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡的影响。方法:设计3对人STAT3 siRNA靶序列,用DNA重组技术克隆至质粒pRNAT-U6.1/neo中,构建重组质粒pRNAT-U6.1-STAT3 siRNA,检测并筛选出最佳抑制效率的siRNA质粒载体。重组质粒转染至缺氧复氧后HKC细胞,Western blotting和Real Time-PCR测定STAT3蛋白和mRNA表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡,间接荧光法测定Bcl-2和Bax表达的变化。结果:靶向STAT3基因表达的质粒载体构建成功,并筛选出抑制效率最佳的重组质粒。缺氧复氧后HKC细胞STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值增加;缺氧复氧后HKC细胞转染重组质粒后STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值明显降低。结论:成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向STAT3的重组质粒载体。该载体可有效抑制缺氧复氧后HKC细胞中STAT3信号转导通路的活化,并进一步通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡。     

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。     

脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测

目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。     

SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的:构建小泛素相关修饰物-1(SUMO-1)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对SUMO-1基因表达的干扰效果。方法:根据SUMO-1基因序列设计一条合理的SUMO-1siRNA,并将其克隆到pSliencer2.1-U6neo载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建的SUMO-1siRNA重组质粒单独转染或与带HA标签的SUMO-1表达载体共同转染人胚肾293T细胞,收集细胞裂解物,以抗HA和SUMO-1的抗体用Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果:构建了SUMO-1siRNA重组质粒,干扰效果可达80%以上。结论:构建的SUMO-1siRNA为进一步进行蛋白质SUMO-1化修饰的研究奠定了基础。     

结缔组织生长因子小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的：构建结缔组织生长因子（CTGF）基因的小干扰RNA（siRNA）,并检测其对CTGF基因表达的干扰效果。方法：根据CTGF基因序列,设计2条合理的CTGF-siRNA,并将其克隆到siRNA载体pSliencer2．1-U6neo中,转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建成功的CTGF-siRNA重组质粒与带nJAG标签的CTGF表达载体共同转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果：构建了2个CTGFpsiRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的干扰效果可达75％以上。结论：构建的CTGF-siRNA可为进一步研究CTGF的功能提供参考。     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

MEKK3基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞MEKK3的表达抑制

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体表达载体,观察其在胃腺癌AGS细胞中对MEKK3的表达抑制。方法设计并合成针对人MEKK3基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluI及XhoI克隆入pRNAT—H1．1／Adeno穿梭载体中,得到的质粒用Pme I线性化后在大肠埃项菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。卡那霉素筛选后,用PacI酶切鉴定。鉴定正确的质粒经Pac I酶切、乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western印迹法检测其对MEKK3蛋白表达的抑制。结果酶切和洲序鉴定表明3个MEKK3 siRNA重组腺病毒表达载体正确无误。Western印迹检测结果显示3个pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒表达载体中有两个可有效地抑制胃腺癌AGS细胞中MEKK3基因的表达,其中以pAd．MEKK3-siRNA3的抑制作用最显著,有效率达89％。结论成功构建了针对MEKK3基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究MEKK3基因在人胃腺癌AGS细胞中的作用和功能奠定了基础。     

干扰MDR1基因表达提高急性早幼粒白血病HT9细胞对紫杉醇的敏感性

以人类急性早幼粒白血病HT9细胞为实验对象,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术干扰MDR1基因表达,提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性。构建了3种靶向MDR1基因的重组干扰载体,稳定转染HT9细胞后,采用qRT-PCR和Western blotting方法,分别检测MDR1基因的m RNA和蛋白表达水平,用MTT法检测各转染组细胞对紫杉醇的敏感性,流式细胞术检测各组细胞药物外排功能。结果显示,成功构建了3种靶向MDR1的重组干扰载体p3.1-1、p3.1-2和p3.1-3。3种重组干扰载体不同程度抑制HT9细胞中MDR1基因的表达,其中重组干扰载体p3.1-3对MDR1基因沉默效果最好,对m RNA和蛋白的沉默效率分别为73.80%和47.61%,与对照组相比,转染p3.1-3重组干扰载体的细胞对紫杉醇的IC50由(1.26±0.17)μg/m L降至(0.46±0.07)μg/m L,逆转率达到(63.48±5.91)%,并且药物外排功能也明显降低。以上实验结果表明,3种靶向MDR1的重组干扰载体均能抑制MDR1基因表达,其中p3.1-3对MDR1基因干扰效果最好,并且能够有效提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性,降低细胞药物外排功能。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。