北京城市发展对土壤微生物群落功能多样性的影响

为研究城市发展对土壤微生物功能多样性的影响,以北京市建成区为例,采用Biolog-ECO微平板技术分析不同环路内3种类型绿地(居民区内绿地、街道边绿地、公园内绿地)土壤微生物群落功能多样性的变化.结果表明:二环内各绿地类型土壤微生物群落的AWCD(average well color development,平均颜色变化率)相对较高,分别为1.107、1.192、1.007,表明其土壤微生物群落代谢活性较高,利用碳源能力较强,其他环路土壤微生物群落利用碳源能力相对较弱;其中,各绿地类型土壤微生物群落对羧酸类碳源的利用能力最弱.城市环路梯度下居民区对土壤微生物群落多样性的影响相对较大;街道对土壤微生物群落功能多样性无显著影响(或者城市环路梯度下街道边绿地土壤微生物群落功能多样性趋同);四环～五环公园内绿地土壤微生物群落功能多样性与其他环路之间存在显著差异.对土壤微生物群落碳源利用能力进行主成分分析的结果显示,居民区内绿地、街道边绿地、公园内绿地提取的与土壤微生物碳源利用相关的主成分累积贡献率分别为86.79%、87.09%、84.92%,对主成分分离起主要作用的碳源主要是氨基酸类、糖类、多聚物类和羧酸类物质.冗余分析(RDA)表明,pH、土壤含水量是影响土壤微生物群落代谢能力和功能多样性的主要因素.城市绿地类型和环路因子对土壤微生物利用碳源分异存在一定影响,但对碳源代谢能力变异的解释量(5.91%)低于土壤理化因子的解释量(16.26%).研究显示,城市环路对土壤微生物功能多样性产生一定影响,但各环路街道边绿地土壤微生物功能多样性无显著差异,并且二环内、二环～三环、三环～四环各绿地类型土壤微生物多样性也无显著差异,说明城市发展可能使土壤微生物群落功能多样性趋于同质化.      

汶川地震灾区不同气候区土壤微生物群落碳源代谢多样性

为探讨汶川地震灾区不同气候区土壤微生物群落功能代谢的变化,采用Biolog-ECO生态板技术,研究了亚热带湿润季风气候和半干旱干热河谷气候未受损区、受损治理区、受损未治理区土壤微生物碳源代谢的多样性变化特征.结果表明,平均颜色变化率(AWCD)在未受损区和受损治理区表现为亚热带湿润季风气候区半干旱干热河谷气候区,在受损未治理区表现为半干旱干热河谷气候区亚热带湿润季风气候区,不同气候区内受损未治理区AWCD值均处于最低水平;亚热带湿润季风气候区土壤微生物的碳源利用类型明显多于半干旱干热河谷气候区,在不同气候类型区内碳源利用种类均表现为受损治理区未受损区受损未治理区的趋势;不同气候区土壤微生物群落碳源代谢多样性特征差异显著,其中多样性指数和均匀度指数均表现为未受损区受损治理区受损未治理区,而受损治理区均具有最高的丰富度指数;土壤微生物群落的碳源代谢特征与土壤养分、地上植被生物量及植被覆盖度具有一定的相关性,表明地震及其次生灾害主要通过对地表植被和土壤环境的作用间接影响土壤微生物群落的碳源利用能力,在不同气候类型区与不同的受损治理情况下土壤微生物群落的碳源代谢特征具有显著差异.     

北京城市公园绿地土壤微生物群落碳源代谢活性特征

为深入理解城市土壤微生物碳源代谢活性,以北京城市公园绿地土壤为研究对象,采用Biolog-ECO微平板技术,研究了不同历史年限公园[AT（奥林匹克森林公园）、CHY（朝阳公园）、YYT（玉渊潭公园）、TRT（陶然亭公园）、RT（日坛公园）、TT（天坛公园）,其建设历史年限分别为8、32、52、317、486、592 a]土壤微生物群落碳源代谢特征.结果表明:北京市不同城市公园绿地土壤微生物利用碳源能力不同,AT的AWCD（平均颜色变化率）显著低于其他历史年限较长的公园（P < 0.05）.不同城市公园绿地土壤微生物群落对不同类型碳源利用能力存在差异,AT土壤微生物对多聚物类碳源代谢能力较强,其他公园绿地土壤微生物对糖类和氨基酸类碳源的利用能力较强,所有公园绿地土壤微生物群落对羧酸类碳源的利用能力相对较弱.AT土壤微生物群落功能多样性显著低于其他公园（P < 0.05）.对土壤微生物群落碳源利用能力进行主成分分析显示,提取与土壤微生物碳源利用相关的主成分的累计贡献率为89.00%,对主成分分离起主要作用的碳源为糖类和氨基酸类物质.冗余分析（RDA）表明,不同城市公园绿地土壤微生物碳源代谢能力的主要影响因素是总碳（TC）,但值得注意的是,公园历史年限对不同城市公园绿地土壤微生物碳源代谢能力也有很强的影响.      

黄土区侵蚀坡面土壤微生物群落功能多样性研究

为研究不同有机碳水平下坡面土壤侵蚀对微生物群落功能多样性的影响,以黄土区典型侵蚀坡面为对象,通过Biolog-Eco方法测定了高、低2个有机碳水平坡面沉积区、侵蚀区和对照区3个不同部位的土壤微生物活性、碳源利用能力和微生物群落功能多样性.结果表明：1）高碳水平下3个部位的微生物活性和碳源利用能力均显著高于低碳水平;2）在不同侵蚀部位上,沉积区微生物活性高于侵蚀区,在低碳水平下,沉积区微生物碳源利用能力显著大于侵蚀区（P<0.05）,但在高碳水平下沉积区与侵蚀区无显著差异;3）在6类碳源中,微生物对氨基酸类、酯类的利用率最高,对醇类、胺类的利用率较低,从31种碳源中提取的主成分1和主成分2分别可解释变量方差的53.8%和11.9%,对主成分1起分异作用的主要是氨基酸类和酯类碳源;对主成分2起分异作用的主要为糖类和酸类碳源.4）高碳水平下3个部位微生物群落的Shannon指数、丰富度指数和McIntosh指数均显著大于低碳水平（P<0.05）,但不同部位间的土壤微生物群落多样性指数并无明显差异.侵蚀对微生物群落功能多样性的影响主要表现在有机碳水平决定的微生物活性差别上,不同部位微生物的碳源利用能力在有机碳水平较低时差异显著,有机碳水平较高时则没有明显差别.     

微生物多样性对土壤碳代谢特征的影响

土壤微生物群落在生态系统过程中发挥着重要的作用,而关于土壤微生物多样性对生态系统功能的影响无一致结论.为了研究微生物多样性对土壤碳代谢特征的影响,将稀释10~(-1)、10~(-3)和10~(-5)倍(D1、D3和D5)的庞泉沟阔叶混交林土壤悬浮液接种在灭菌的土样中.通过碱式滴定法和Biolog Eco板等实验方法测定了不同多样性梯度下土壤碳矿化速率和碳代谢利用模式的变化.结果表明培养6周后,D1处理的碳矿化速率、累积碳矿化量、平均孔颜色变化率(AWCD)和多样性指数(Shannon、Mc Intosh和丰富度指数)均显著高于D5处理.且相关分析表明,累积碳矿化量和AWCD与丰富度呈显著负相关.对碳源吸光度做主成分分析(PCA)和单因素方差分析发现微生物多样性梯度的土壤碳源利用模式也存在差异.因此,微生物多样性下降影响土壤的碳矿化速率和碳源利用模式,导致陆地生态系统的功能发生改变,在森林土壤管理中,应重视土壤微生物物种多样性变化对生态系统功能的影响.     

喀斯特高原退化湿地草海土壤微生物群落碳源代谢活性研究

为了揭示土壤微生物群落功能多样性对湿地退化过程的响应及其与环境因子的关系,采用BIOLOG-ECO微平板法对喀斯特高原湿地草海不同植被演替阶段根际土壤微生物的碳源代谢活性进行了研究.结果表明,沿湿地植被演替梯度,根际土壤微生物群落碳源代谢强度逐渐增加,原生湿地竹叶眼子菜(Comm.Potamogeton malaianu)根际土壤微生物碳源利用能力最低,碳源代谢类型单一;草甸灯芯草(Juncus effusus L.)群落利用能力最强,碳源代谢类型丰富;Shannon指数(H')和Mc Intosh指数(U)均沿植被演替梯度逐渐升高,这可能与地上植物和土壤理化环境变化有关;主成分分析(PCA)提取的3个主成分累计贡献率为92.85%,能够很好解释不同阶段碳源利用的分异,醇类和氨基酸类是引起碳源利用分异的主要基质;冗余分析(RDA)表明,环境因子对微生物碳源代谢活性具有重要影响,p H、DOC是引起碳源利用分异的主要环境因子.土壤微生物群落碳源代谢活性影响湿地碳循环功能.     

杭州市空气微生物群落碳代谢特征研究

利用Biolog技术,研究了杭州市4个样点,即延安路商业街(Yan’an Road Business Street,YRBS)、天目山路与教工路口(Tianmushan Jiaogong Cross Road,TJCR)、浙江工商大学教工路校区(Zhejiang Gongshang University Jiaogong Campus,ZJGUSJC)、西湖曲院风荷(Breeze-ruffled Lotus at Quyuan Garden,BLQG)空气微生物群落碳代谢特征.结果表明,不同样点空气微生物样品平均颜色变化率(Average Well Color Development,AWCD)在培养240 h后达到稳定,并且4个样点的AWCD值即对单一碳源的利用能力具有显著差异,YRBS>TJCR≈ZJGSUJC>BLQG;YRBS、TJCR、ZJGSUJC和BLQG空气中微生物物种的多样性和丰富度依次减少;不同样点空气微生物对糖类和氨基酸类碳源利用程度较高,对其它碳源利用程度较低,且同一样点对不同单一碳源的利用程度也存在显著差异,YRBS对糖类碳源的利用程度最高,对聚合物类碳源利用程度最低,BLQG对糖类碳源的利用程度最高,对胺类碳源利用程度最低;不同样点空气微生物群落碳代谢基质主成分1(PC1)贡献度为43.8%,主成分2(PC2)贡献度23.4%,YRBS、BLQG和TJCR的空气微生物群落差异较大,碳代谢功能差异显著,而TJCR与ZJGSUJC碳代谢功能无显著差异.     

人工湿地基质微生物群落的碳源代谢特性

利用Biolog微平板技术研究了水平潜流人工湿地基质微生物群落结构及代谢特性,结果表明,供试人工湿地基质微生物群落的碳源代谢能力,床体上层高于床体下层,前部高于后部.在实验期内,前部上层样点平均色度变化(AWCD)值增长速率较前部下层、后部上层及后部下层分别高出83.3%、15.8%和57.1%.主成分分析(PCA)结果表明,不同部位的基质微生物群落具有不同的群落结构和代谢特征,其对不同碳源的利用能力也存在显著性差异(P<0.05),前部上层基质微生物利用率较高的碳源为糖类和氨基酸,而前部下层对聚合物和羧酸的代谢程度最高.功能多样性指标分析表明,基质上层微生物群落丰度、均匀性和多样性指标均高于下层,前部下层微生物群落的均匀性指数显著低于其他取样点,存在较强的优势种;后部下层的丰度指数则明显低于其他采样部位.     

三江平原不同类型小叶章湿地土壤细菌群落功能多样性

为全面了解三江平原小叶章湿地土壤细菌功能多样性的变化规律,采用Biolog-ECO微平板法对三江平原内不同类型小叶章湿地(草甸化小叶章湿地、沼泽化草甸小叶章湿地和沼泽化小叶章湿地)的土壤细菌群落功能多样性变化规律和特点进行分析.结果表明:不同类型小叶章湿地土壤理化性质差异显著(P<0.05).土壤细菌群落平均颜色变化率(AWCD)随培养时间的延长而增加,不同类型湿地土壤细菌群落代谢活性表现为草甸化小叶章湿地>沼泽化草甸小叶章湿地>沼泽化小叶章湿地;土壤细菌群落多样性之间差异显著(P<0.05),草甸小叶章湿地土壤微生物的Shannon-Wiener多样性指数和McIntosh指数最高,分别为3.30和64.03;沼泽化草甸小叶章湿地次之,分别为3.23和60.63;沼泽化小叶章湿地最低,分别为3.19和54.21.Shannon-Wiener多样性指数和McIntosh指数与平均颜色变化率变化规律一致,说明土壤细菌群落结构受到土壤理化性质的影响,并且随着土壤含水量的升高,土壤细菌群落的平均颜色变化率和多样性均呈下降趋势.土壤细菌群落对不同碳源的利用强度上存在明显差异,其中对碳水化合物类、氨基酸类碳源的利用强度差异不大(P>0.05),但是对羧酸类、胺类、酚酸类、多聚物类碳源的利用强度差异显著(P<0.05).主成分分析(PCA)表明,两个主成分累计贡献率为80%,能够很好地解释不同湿地土壤细菌在碳源利用上有明显的空间分异这一现象.碳水化合物类碳源对土壤细菌群落多样性的影响最高,其次是氨基酸类和羧酸类碳源.研究显示,土壤理化性质及植被群落组成是影响小叶章湿地土壤细菌群落组成和功能活性的重要因素.      

复垦红壤中牧草根际微生物群落功能多样性

通过盆栽试验研究了浙江省诸暨铜矿区复垦红壤牧草根际微生物生物量及群落功能多样性的变化.结果表明,种植不同牧草使矿区土壤根际微生物生物量碳发生了显著的变化,其影响大小因矿区土壤污染程度而异.无污染和轻度污染土壤根际微生物生物量碳变化表现为黑麦草+三叶草>三叶草>黑麦草>未种植土壤,处理间差异均达显著水平(P<0.05),重度污染环境下各处理间差异不明显.Biolog数据分析显示,种植不同牧草的矿区土壤根际微生物群落结构和功能多样性也发生了相应改变,根际土壤微生物群落代谢剖面(AWCD)均显著高于未种植牧草土壤,处理间差异达极显著水平(P<0.001).典型变量分析揭示了不同牧草根际微生物群落利用碳源种类和数量存在明显差异.     

莠去津对野生植物群落下土壤微生物功能多样性的影响

为探明亚致死剂量农药对土壤微生物多样性影响,基于大田控制试验,采用Biolog-ECO微平板技术分析喷施亚致死剂量的莠去津对野生植物群落下土壤微生物群落功能多样性的影响.结果表明:① 莠去津的喷施浓度对土壤微生物群落利用全部碳源的能力无显著影响（P>0.05）,但与喷施处理后第30天相比,处理后第60天的土壤微生物群落利用全部碳源的能力有所降低,其中处理Ⅰ〔喷施浓度（以质量浓度计）为1 200 g/hm2〕、处理Ⅲ（喷施浓度为300 g/hm2）显著下降（P < 0.05）,而CK（对照组）、处理Ⅱ（喷施浓度为600 g/hm2）降低程度不显著（P>0.05）,并且其各处理间土壤微生物群落对全部碳源的利用能力大小为CK >处理Ⅲ >处理Ⅱ >处理Ⅰ.② 喷施处理后第30天土壤微生物群落对碳水化合物类碳源的利用能力最强,对羧酸类碳源的利用能力相对较弱;喷施处理后第60天土壤微生物群落对碳水化合物类碳源的利用能力降幅最大,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ分别下降了0.63、0.78、0.85、0.76.③ 喷施除草剂后第30天处理Ⅱ的Shannon-Wiener指数和Simpson指数显著低于其他处理（P < 0.05）,而第60天各处理间多样性指数无显著差异;与喷施处理后第30天相比,第60天各处理多样性指数都有所下降,但没有显著差异（P>0.05）.④ 对土壤微生物群落碳源利用能力进行主成分分析结果显示,提取的与土壤微生物碳源利用相关的主成分累积贡献率为86.6%,主成分1能够区分喷施处理后两个时期的土壤微生物群落特征.⑤ 冗余分析（RDA）表明,pH是土壤微生物利用碳源能力差异的重要影响因素之一.研究显示,除草剂莠去津的施用可在一定程度上降低野生植物群落下土壤微生物群落功能多样性.      

不同森林土壤微生物群落对Biolog-GN板碳源的利用

应用Biolog方法研究了不同森林恢复类型（人工恢复的湿地松林、杉木林、油茶林和自然恢复的天然次生林）土壤微生物群落对Biolog-GN板不同类型碳源的利用情况,结果表明,自然恢复的天然次生林土壤微生物群落的碳源代谢能力比3种人工林强,其次是油茶林.4种森林类型土壤微生物群落比较偏好、利用率较高的3类碳源是糖类、羧酸类和氨基酸类.对4类森林恢复类型土壤微生物群落具有分异作用的主要碳源类型亦为糖类、羧酸类和氨基酸类,这3类碳源是研究森林恢复后导致土壤微生物群落变化的敏感碳源.     

稻草还田对土壤微生物群落功能多样性的影响

为了探讨稻草还田的微生物学过程与效应,借助平板涂抹法和BIOLOG检测法,比较研究了免耕条件下3种不同稻草还田量(33%、67%和100%,以稻草不还田土壤为对照)对晚稻田土壤微生物群落功能多样性的影响.结果表明:①土壤细菌数量差异显著,以67%稻草还田处理为最高,稻草不还田处理最低,稻草还田提高了土壤细菌数量;②碳源平均颜色变化率(AWCD法)在培养早期各处理间的差异不大,但随着培养时间的延长,67%和100%稻草还田处理土壤微生物的AWCD值显著大于对照和33%稻草还田处理组;③土壤微生物代谢多样性指数(丰富度和多样性)在3种稻草还田量处理土壤中也表现出明显差异,67%和100%稻草还田处理的土壤中微生物功能多样性显著大于33%稻草还田处理和对照;④67%和100%稻草还田处理显著改善了土壤微生物的功能多样性.以67%稻草还田处理改善土壤微生物群落结构和功能的效果最为显著.     

生物炭复合青霉菌修复砷污染土壤对其微生物群落功能多样性的影响

真菌修复砷污染土壤是一种能够有效吸附固化环境中砷的重要措施.生物炭作为目前修复重金属的热点,其多空疏松的结构、较高的离子交换量、丰富的有机碳含量等都说明了其在土壤修复中的地位.为了探究生物炭与青霉菌在修复砷污染土壤的同时对土壤中微生物活性及其多样性的影响,在室内孵育条件下,运用Biolog法研究了3×3随机区组试验（3个生物炭梯度分别为0%、2%、4%,3个青霉菌梯度分别为0%、10%、20%）下土壤微生物对不同类型碳源的利用能力以及多种功能性指数的影响.结果表明:①添加青霉菌与生物炭后,土壤中有效砷含量较对照组显著下降,从而影响其微生物群落功能多样性.②砷污染土壤中微生物群落功能多样性、碳源利用丰富度随生物炭浓度梯度的升高呈先升后降的趋势.③高接菌量（20%）与低接菌量（10%）对砷污染土壤中微生物群落功能多样性的影响没有显著性差异.④2%生物炭与10%青霉菌处理土壤中微生物群落功能多样性、碳源利用丰度最高.⑤青霉菌对胺类及少部分酸类碳源的利用能力较弱（AWCD < 0.5,AWCD为Biolog微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率）,对氨基酸类中大部分碳源以及脂类碳源的代谢能力较强（AWCD>1.0）,对糖类、酚酸类的代谢能力稍弱（AWCD为0.3~1.0）,青霉菌对D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、r-羟基丁酸这5种碳源的利用率最高（AWCD>1.2）.研究显示,低浓度生物炭可增加砷污染土壤中微生物群落多样性,生物炭含量的继续增加会对微生物产生抑制作用;青霉菌添加到砷污染土壤后,会显著提升砷污染土壤中微生物的群落功能多样性,改善砷污染土壤中微生的物群落结构;青霉菌的优势碳源大多为植物根系分泌物,可为后续青霉菌与超积累植物复合修复砷污染土壤提供参考.      

Fungal diversity in major oil-shale mines in China

As an insufficiently utilized energy resource,oil shale is conducive to the formation of characteristic microbial communities due to its special geological origins.However,little is known about fungal diversity in oil shale.Polymerase chain reaction cloning was used to construct the fungal ribosomal deoxyribonucleic acid internal transcribed spacer(r DNA ITS)clone libraries of Huadian Mine in Jilin Province,Maoming Mine in Guangdong Province,and Fushun Mine in Liaoning Province.Pure culture and molecular identification were applied for the isolation of cultivable fungi in fresh oil shale of each mine.Results of clone libraries indicated that each mine had over 50% Ascomycota(58.4%–98.9%)and 1.1%–13.5%unidentified fungi.Fushun Mine and Huadian Mine had 5.9% and 28.1% Basidiomycota,respectively.Huadian Mine showed the highest fungal diversity,followed by Fushun Mine and Maoming Mine.Jaccard indexes showed that the similarities between any two of three fungal communities at the genus level were very low,indicating that fungi in each mine developed independently during the long geological adaptation and formed a community composition fitting the environment.In the fresh oil-shale samples of the three mines,cultivable fungal phyla were consistent with the results of clone libraries.Fifteen genera and several unidentified fungi were identified as Ascomycota and Basidiomycota using pure culture.Penicillium was the only genus found in all three mines.These findings contributed to gaining a clear understanding of current fungal resources in major oil-shale mines in China and provided useful information for relevant studies on isolation of indigenous fungi carrying functional genes from oil shale.     

原始红松林退化演替后土壤微生物功能多样性的变化

为了全面了解原始红松林退化演替为次生林后土壤生境及土壤微生物功能多样性的变化规律,以小兴安岭典型的原始阔叶红松林、退化演替后先锋阶段的白桦林及亚顶级阶段的硬阔叶林为研究对象,采用Biolog-ECO微平板检测法,分析三者0~ < 10 cm和10~20 cm表层土的土壤微生物功能多样性变化规律.结果表明:各林型土壤微生物的AWCD值（平均颜色变化率）随培养时间的延长而增加,培养初期表现为原始阔叶红松林>硬阔叶林>白桦林;培养末期表现为原始阔叶红松林>白桦林>硬阔叶林,三者的AWCD值在0~ < 10 cm土层分别为1.06、0.86、0.81,10~20 cm土层分别为0.68、0.47、0.45,原始林显著高于次生林（P < 0.05）,说明原始林土壤微生物对单一碳源的代谢活性显著高于次生林;同一林型下土壤微生物的AWCD值均表现为0~ < 10 cm土层显著高于10~20 cm土层（P < 0.05）. Shannon-Wiener多样性指数、Simpson指数、McIntosh指数和Richness丰富度指数也均表现为原始林显著高于次生林（P < 0.05）.原始林土壤微生物对各类碳源的综合利用强度均大于次生林,不同林型下土壤微生物群落的优势碳源类型存在一定的差异,碳水类、氨基酸类、羧酸类和多聚物类碳源是原始林退化演替后土壤微生物群落在碳源利用上发生变化的敏感碳源.      

好氧堆肥微生物代谢多样性及其细菌群落结构

好氧堆肥是农业废弃物无害化处理和资源化利用的一条有效途径.为了探究好氧堆肥过程中微生物群落的代谢特征和细菌群落演替现象,了解起关键作用的微生物菌群,通过筛选强降解菌种改善堆肥工艺、提高堆肥效率,采用Biolog法和宏基因组法分析了玉米秸秆和牛粪联合好氧堆肥过程中微生物的碳源代谢能力和细菌群落多样性.结果表明:在第2次翻堆（第14天）时,微生物利用碳源的能力最强,初次建堆时（0 d）和其余翻堆时（第8、20、26天）次之,发酵结束时（第34天）最弱.Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh多样性指数表明,建堆时及翻堆时的菌群优势度、丰富度和均匀度均极显著优于好氧堆肥结束.不同好氧发酵时间的微生物群落对同一碳源代谢有差异,同一好氧发酵时间微生物群落对不同碳源的利用率不同.糖类、酸类和醇类是区分好氧堆肥不同时间微生物碳源利用差异的敏感碳源.好氧堆肥不同时间细菌的种类和丰度不同,共享的优势菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）,在第0、8、14、20、26、34天这6个时间内它们的相对丰度之和分别达90.27%、90.34%、94.26%、84.21%、84.31%和77.61%,且6种门类在不同发酵时间的丰度表达存在消长变化状态.研究显示,参与好氧堆肥不同时间的微生物群落在碳源代谢能力上存在多样性,在细菌菌群的种类和丰度上也存在多样性.