表皮生长因子对传代培养的大鼠生长板软骨细胞增殖与胶原合成的影响

目的：探讨不同浓度的表皮生长因子（EGF）对传代培养的大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）增殖和胶原合成的影响。 方法： 分离、培养RGC，分别用Western blot和阿尔新蓝（Alcine blue）染色检测各代RGC中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达；用［³H］-TdR和［³H］-proline掺入分别检测1、10和100 μg/L EGF对第1、3和5代RGC增殖和胶原合成的影响。 结果： 原代培养的RGC表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖，从第4代起Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达迅速降低，RGC发生了去分化。［³H］-TdR掺入表明，EGF促进第1代RGC的增殖（P<0.01），3个浓度的作用依次为：1 μg/L>10 μg/L>100 μg/L，差异显著（P<0.01）；3个浓度的EGF对第3代RGC保持了相近的促增殖作用（P<0.01）；对第5代RGC均无促增殖作用(P>0.05)。与促增殖作用不同，不同浓度EGF促不同传代的RGC的［³H］-proline掺入率比对照组均高20%左右（P<0.01）。 结论： EGF具有促进培养RGC增殖和胶原合成的作用，连续传代引起的去分化降低了RGC对EGF促增殖作用的反应，但对EGF的促胶原合成作用没有产生影响。     

Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞

背景：建立一种经济、快捷、切实可行的软骨细胞分离培养体系对于软骨体外实验研究有着重要的意义。 目的：探讨与改进大鼠关节软骨细胞的培养方法。 方法：无菌条件下取新生1周龄SD雄性大鼠双侧髋及膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞并进行原代、传代培养及鉴定。 结果与结论：倒置相差显微镜下见原代培养的软骨细胞12 h后开始贴壁,3 d左右可形成单层,4 d左右即可传代。传至第6代后,部分细胞变为梭形;第7代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状,增殖能力减弱。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈异染性,免疫荧光染色显示培养的软骨细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达。说明采用此方法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞。     

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

背景：兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型,关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可。 目的：观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象。 方法：将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代,对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数,显微镜观察,F机动蛋白染色、番红O染色,糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较。 结果与结论：光学显微镜下,兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形,逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态,对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化。细胞计数结果表明,细胞增殖能力随代次增加显著下降,特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖;经过番红O染色以及定量测定糖胺聚糖的含量,发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低。半定量聚合链式反应检测结果表明,随着传代次数的增加,特别是第3代以后,软骨相关特征分子(包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等)基因表达水平下调;而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调,同时,细胞表面分子CD90基因表达上调,而CD14基因表达未见明显变化。结果证实,兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象,呈现出特征基因表达水平的变化,第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复。     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景：髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。 目的：体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。 方法：经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。 结果与结论：分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2 d的生长潜伏期,3 d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。     

PDBu对大鼠生长板软骨细胞增殖和分化的影响

目的探讨蛋白激酶C(PKC)对生长板软骨细胞增殖、细胞外基质合成和转录因子SOX9表达的影响。方法分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(RGC),分别采用倒置显微镜、同位素掺入、RT-PCR和Western blot方法检测1、10和100nmol/L的PKC激动剂PDBu对第一代无血清培养RGC的细胞形态、增殖、胶原和蛋白多糖的合成及COL2A1和AGGRECAN的转录及转录因子SOX9表达的影响。结果100nmol/LPDBu的处理,使无血清培养RGC的细胞形态接近于血清组(10?S);抑制增殖并促进胶原和蛋白多糖的合成,3H-TdR、3H-proline和35S-sulfate掺入量分别是无血清对照组的83%、152.6%和146.5%(P<0.05);促进COL2A1和AGGRECAN的转录和SOX9的表达。结论PKC的活化抑制了生长板软骨细胞增殖,促进其分化。     

单层培养的人关节软骨细胞生物学行为研究

目的：研究单层培养的人关节软骨细胞生物学行为的改变。方法：对来自8例手术切除负重关节非负重区的软骨细胞在10％DMEM中进行单层传代培养，观察细胞形态学、增殖细胞倍增时间（DT）、细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及流式细胞分析细胞增殖指数（P1）和细胞凋亡。结果：随着传代次数的增加，（1）细胞形态由原代的多角形转变为第3、4代的短梭形、第8、9代的成纤维细胞形态；（2）DT在逐渐延长，P1在逐渐减小；（3）细胞分泌的Ⅱ型胶原逐渐减少；（4）细胞凋亡指数未见明显的改变（P〉0．05）。结论：体外单层培养的关节软骨细胞存在着失分化和老化，但第3、4代能较好地保持软骨细胞的生物学行为，可作为种子细胞的来源。     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养:两者培养比例筛选

背景:骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。目的:拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。方法:软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组:单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7:3,5:5,3:7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。结果与结论:共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1~G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5:5,3:7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5:5或3:7的比例为最佳。     

京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响

背景：京尼平苷能够促进韧带成纤维细胞的增殖和胶原的合成,促进组织的修复和韧带损伤的愈合。 目的：观察京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响。 方法：采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养,并取第4代细胞给予0,25,50,100 mmol/L京尼平苷干预,利用MTT比色、流式细胞仪检测细胞周期等方法检测药物干预后第4代软骨细胞的增殖情况。 结果与结论：体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;且随着培养时间的延长及京尼平苷浓度的升高,软骨细胞增殖更为显著(P < 0.01)。     

兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征

背景:软骨细胞是软骨破坏过程中的靶细胞,也是分泌炎性细胞因子的主要细胞之一,体外分离培养骨关节炎软骨细胞存在难度。目的:对兔膝关节软骨细胞进行分离和培养,观察兔软骨细胞的形态学特性。方法:4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法,通过调整胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的浓度及消化时间来获得较纯的关节软骨细胞,传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态、绘制生长曲线、苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果与结论:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次后出现反分化。形态学、免疫荧光染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定,90%以上的软骨细胞维持多角形或三角形,核为圆形或椭圆形。苏木精-伊红阳性染色为细胞核呈紫蓝色,软骨细胞基质红染,胞浆及细胞周围有紫红色、阿利新蓝染色可见细胞浆和胞膜呈深蓝色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见胞浆和胞膜清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光。结果提示,实验成功建立了软骨细胞分离、培养体系,且3代以内90%以上的软骨细胞生长良好。     

Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

背景：目前关节软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟,但是研究中发现通过目前技术培养的软骨细胞生长周期慢,容易出现退变现象,不利于后续试验的进行。 目的：改进并探讨4周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞的分离与培养的方法。 方法：无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定;MTT法检测关节软骨细胞增殖情况。 结果与结论：倒置显微镜下见膝关节软骨分离的原代软骨细胞6 h后开始贴壁,72 h可形成单层,96 h即可传代;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;第4,5代软骨细胞增殖能力减弱,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色阳性表达;MTT法检测表明前3代软骨细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05),且第1-3代与4代软骨细胞在培养第4-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05),与第5代软骨细胞在培养1-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)。提示采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法能够获得大量生长速度快且不宜退变的新西兰大白兔膝关节软骨细胞,且培养的前3代新西兰兔膝关节软骨细胞最为适宜。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

染料木黄酮抑制生长板软骨细胞的增殖与基质合成

目的： 探讨染料木黄酮对大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）的形态、增殖和胞外基质成分合成的影响。方法： 原代培养RGC，1×10^－6 μmol/L-1×10^－4 μmol/L染料木黄酮处理第1代RGC 24 h，观察RGC形态，同位素掺入检测RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成，RT-PCR检测collagen Ⅱ和aggrecan基因表达。结果： 染料木黄酮改变了RGC的形态，随着浓度的升高，突起和漂浮细胞的数量增加。染料木黄酮剂量依赖性地抑制RGC的增殖、胶原和蛋白多糖的合成（P<0.05），以及collagenⅡ和aggrecan mRNA的转录。结论： 染料木黄酮抑制RGC的增殖和胞外基质的合成。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？ 目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。 方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21 d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。 结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

自体血清培养新西兰大白兔关节软骨细胞

目的：改进与探讨新西兰大白兔软骨细胞体外培养的方法。方法：取3月龄新西兰大白兔自体血,制备自体血清备用,无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并应用新西兰大白兔自体血清进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对膝关节软骨细胞进行鉴定,MTT法检测软骨细胞的增值能力;结果：倒置显微镜下见原代软骨细胞2 h后开始贴壁,8 h可形成单层,24 h即可传代。第1~5代细胞表型稳定,增殖力良好。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈深染色,细胞质呈淡蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色表达,MTT检测显示前5代软骨细胞增值能力强,无明显差异;结论：结果表明自体血培养的前5代新西兰大白兔节软骨细胞均可用于膝骨关节炎的研究。     

胰岛素样生长因子I与透明质酸对人关节软骨细胞的作用

目的探讨胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸(HA)联合培养对人关节软骨细胞增殖及其生物学行为的影响.方法分离培养人关节软骨细胞,分4组,分别为对照组、IGF-I组、HA组和IGF-I+HA组.加入不同浓度的IGF-I、HA、IGF-I和HA,用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同时间点软骨细胞增殖活性的变化.从第4代开始,用IGF-I和HA联合培养,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化.自然传代的第6代细胞为对照组.结果 IGF-I在10μg/L浓度时即可明显促进软骨细胞的增殖,当IGF-I浓度为50μg/L时,其促增殖作用达最大值.单独应用不同浓度的HA对人关节软骨细胞的促增殖作用不明显.联合应用IGF-I与HA对软骨细胞的增殖具有协同效应并使促增殖作用时间后延.IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞质内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡;RT-PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性;甲苯胺蓝染色显示细胞质内有大量的紫色异染颗粒;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见92%的细胞染色呈阳性或强阳性,平均灰度分别为85.92±9.71和116.23±16.69.而对照组的平均灰度值分别为105.12±12.20和135.68±10.65,二者均显著低于对照组(P<0.01).结论 IGF-I明显促进软骨细胞的增殖;HA对软骨细胞的增殖无影响;二者联合培养促增殖能力更强,并且能有效地保持软骨细胞表型的稳定.     

软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨

背景：滑膜间充质干细胞在体外具有多向分化的能力,有望成为软骨组织工程中治疗软骨缺损的种子细胞,在其向软骨细胞分化过程中,合适的生长因子起了重要作用。 目的：利用富含生长因子的软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化,并对其鉴定。 方法：采用消化法分别获得SD大鼠滑膜间充质干细胞、软骨细胞。收集软骨细胞上清液离心、过滤冻存备用。培养滑膜间充质干细胞至第3代后离心成微团,并用软骨细胞上清液进行成软骨诱导分化,通过形态学观察、免疫组织化学法、RT-PCR检测进行鉴定。 结果与结论：滑膜间充质干细胞使用软骨细胞上清液成软骨诱导21 d后,微团可见似软骨样组织。免疫组化法进行Ⅱ型胶原鉴定,基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。RT-PCR结果显示诱导后的微团表达软骨特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。证实软骨细胞分泌的可溶性因子可以诱导大鼠滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。 目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。 方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7 d和14 d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14 d后细胞在支架材料上的生长状况。 结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义(P  < 0.05),诱导  14 d与诱导7 d相比,差异亦有显著性意义(P < 0.05)。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14 d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14 d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。     

小鼠间充质干细胞三系分化中SOX9与Ⅱ型胶原mRNA的定量

背景：研究表明,软骨中的主要成分Ⅱ型胶原的基因-Col2a1在软骨细胞中的表达与SOX9 的浓度呈剂量依赖正相关关系。 目的：通过成骨、成软骨、成脂肪诱导干细胞分化,分析3种分化过程及不同时期的SOX9与Ⅱ型胶原 mRNA含量的变化,探讨SOX9在不同时空分布的表达规律及与Ⅱ型胶原的相关关系。 方法：取4周龄昆明小鼠骨髓间充质细胞,体外培养得到间充质干细胞并传达至第3代,对间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定细胞表型,共分3组每组设3个时间段,通过成骨、成软骨、成脂肪3种诱导培养液对3组细胞进行诱导,另设不进行诱导的细胞作为对照组。分别在诱导3,7,14 d后收集提取细胞的总RNA,通过RT-PCR进行SOX9与Ⅱ型胶原的mRNA定量检测,同时对诱导后的细胞进行染色、免疫荧光染色,观察其分化状态及相关统计分析。 结果与结论：第3代骨髓间充质干细胞生长良好,流式细胞仪鉴定细胞表型证实为干细胞,对诱导后细胞进行染色、免疫荧光染色结果证实细胞分化为骨、软骨、脂肪细胞。经RT-PCR检测,在3组诱导分化细胞中SOX9 mRNA含量由高到低分别是成软骨、成骨、成脂肪,Ⅱ型胶原 mRNA含量由高到低分别是成软骨、成脂肪、成骨。在成软骨分化中SOX9在3,7 d表达不断升高,14 d呈下降趋势。Ⅱ型胶原在3,7,14 d均逐渐升高。在成骨分化中SOX9 mRNA含量随着时间推移而增加,而Ⅱ型胶原则随着时间推移而不断降低。在成脂肪分化中SOX9 mRNA表达与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05);而Ⅱ型胶原的表达没有规律可循,时间点的延伸及检测未观察到。结果提示,SOX9在软骨分化中作用优于成骨、成脂肪组,且软骨分化中SOX9与Ⅱ型胶原存在相关性,可能在软骨分化的早期Ⅱ型胶原随着SOX9的变化而变化;且软骨分化和成骨分化过程中SOX9可能起到了一个互相协调促进平衡的关键作用。     

成人骨髓多能成体祖细胞生物学性状及向成软骨样细胞的诱导分化

背景：骨髓多能成体祖细胞具有比骨髓间充质干细胞更强的分化潜能和扩增能力并具有胚胎干细胞样的多向分化潜能,但分化为成软骨样细胞的研究目前少见报道。 目的：观察成人骨髓成体多能祖细胞的体外培养条件、生物学特性及其向成软骨样细胞分化的可能性。 方法：观察体外培养成人骨髓成体多能祖细胞的形态、生长情况,并鉴定;以分化培养基诱导成人骨髓成体多能祖细胞向无软骨细胞分化。 结果与结论：光学显微镜下观察培养的成人骨髓多能成体祖细胞体积偏大,长多角型,数个细长伪足,细胞核大,细胞质丰富,细胞增殖能力旺盛;可见转录因子4、阶段特异性胚胎表面抗原1表达,未见T细胞表面黏附分子CD44,CD45,CD133和主要组织相容性抗原系统Ⅱ的表达;诱导分化后,分化细胞经甲苯胺蓝染色后呈异染性,可表达Ⅱ型胶原。证实,实验成功体外培养了成人骨髓多能成体祖细胞,骨髓多能成体祖细胞在一定诱导条件下具有向成软骨样细胞分化的潜能。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。