慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系建立

目的建立稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系。方法构建pHBLV-U6-ZsGreen-Puro质粒,制备慢转录病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro-miR-218和pHBLV-U6-ZsGreenPuro-vector转染膀胱癌T24细胞系,用嘌呤霉素筛选并荧光显微镜和qRT-PCR检测。结果转染的细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)显示实验组细胞microRNA-218表达水平比对照组升高250倍。结论该实验成功建立了稳定高表达MicroRNA-218膀胱癌T24细胞系,为进一步研究microRNA-218在膀胱癌中的功能奠定了基础。     

结核感染T细胞检测在结核病诊断中的临床意义

目的分析结核感染T细胞检测在结核病诊断中的临床意义。方法选取我院2015年3月~2016年4月收治的250例疑似结核病患者,患者均给予结核感染T细胞检测、聚合酶链式反应(PCR)荧光探针检测及涂片抗酸染色检测,比较三种检测方法检出结核病的阳性率。结果 165例患者最后确认为结核病,结核感染T细胞检出的阳性率分别显著高于PCR荧光探针检测和涂片抗酸染色检测(P0.05),且PCR荧光探针检测的阳性率显著高于涂片抗酸染色检测(P0.05)。结论应用结核感染T细胞检测来诊断结核病,能有效提高临床检测阳性率,其具备了临床推广的价值。     

2型糖尿病患者FOX01 mRNA表达水平的变化及其意义

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者外周血单个核细胞(PBMC)中分叉头框(forkhead box,FOX)转录因子-1 mRNA表达水平的变化,了解它在T2DM发病中的作用。方法采用RT-PCR法和实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法对62例T2DM患者和40例健康人检测PBMC中FOX01 mRNA表达水平。结果T2DM患者PBMC中FOX01 mRNA表达水平明显高于健康对照组(P<0.05)。结论T2DM患者的FOX01 mRNA表达较健康对照组表达增加。     

Tα1启动子驱动的荧光报告系统在人胚胎干细胞神经分化示踪中的应用

目的观察携带Tα1(α-tubulin)基因启动子驱动的荧光报告系统在人胚胎干细胞(h ESCs)神经分化示踪中的应用。方法胎鼠成纤维细胞(MEF)培养h ESCs,免疫荧光染色鉴定其生物学标记。将携带p LV/Final-puro-Tα1(α-tubulin)-hr GFP载体的慢病毒感染人胚胎干细胞(h ESCs),嘌呤霉素(puromycin)筛选14 d后获得纯化h ESCs,并诱导其向神经元样细胞分化,同时显微镜观察细胞绿色荧光变化。第23天对表达绿色荧光的细胞行免疫荧光染色鉴定。结果 h ESCs细胞的OCT-4、SSEA-4及TRA-1-60表达呈强阳性。慢病毒感染并筛选14 d后得到具有puromycin抗性的纯化h ESCs。该细胞经神经分化后,显微镜下观察到绿色荧光表达,且α-tubulin、βⅢ-tubulin、nestin表达均呈阳性。结论成功获得了表达Tα1(α-tubulin)-hr GFP载体的h ESCs,该细胞可以示踪Tα1的表达。     

T1期非肌层浸润性膀胱癌组织中FGFR3与CDKN2A的表达对预后的预测价值

目的 观察成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)在T1期非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的表达情况,及其对预后的预测价值.方法 回顾性收集62例T1期NMIBC患者的肿瘤组织蜡块,所有患者均行经尿道膀胱电切术.应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测FGFR3...     

新型冠状病毒核酸检测的性能验证及评价

目的 验证实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测系统的主要性能.方法 参考《医学实验室质量和能力的要求》第1部分通用要求GB/T22576.1-2018和第10部分分子生物检验学领域的要求GB/T22576.10-2018对该实验室RT-qPCR检测SARS-CoV-2核...     

慢病毒介导的人Bax基因和人肝细胞生长因子基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的共表达

目的构建绿色荧光蛋白标记的人Bax基因(hBax)和人肝细胞生长因子基因(hHGF)双基因共表达的重组慢病毒。证实已包装成功的慢病毒能感染正常细胞并表达目的蛋白。方法通过重叠PCR技术构建attB1-K-hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF-attB2基因片段,利用gateway technology构建慢病毒载体质粒pLV.EX2d.null-EF1A>hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF和阴性对照质粒pLV.EX2d.null-EF1A>eGFP并测序,上述两种质粒分别与辅助质粒共转染293FT细胞包装病毒,荧光显微镜检测病毒滴度。实验分为实验组(感染了共表达Bax和HGF的慢病毒)、阴性对照组(仅感染了表达绿色荧光的慢病毒)和空白组(未作任何处理的正常NIH3T3细胞)三组,RT-PCR和Western blot检测染毒后各组细胞Bax和HGF的表达。结果经鉴定慢病毒载体质粒构建正确,荧光显微镜检测hBax和hHGF共表达慢病毒滴度为7.8×107TU/ml,仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度为9×107TU/ml。将包装成功的慢病毒感染NIH3T3细胞48h后,RT-PCR和Western blot结果显示实验组与其他两组相比,Bax和HGF的表达明显上调(P<0.05)。结论标记增强型绿色荧光蛋白的表达hBax和hHGF双基因慢病毒构建成功并获得高滴度的病毒感染液。通过慢病毒感染途径成功将HGF和Bax基因导入NIH3T3细胞并表达蛋白,为进一步研究Bax和HGF双基因共表达的重组慢病毒对血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的影响奠定了基础。     

儿童慢性 ITP 外周血 CD3 + T 细胞活性氧的检测及临床意义

目的　探讨儿童慢性特发性血小板减少性紫癜 (Idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP) 外周血 CD3+ T 细胞中活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 含量及其与血小板的关系，为临床诊断和治疗提供依据。方法　随机收集 30 例慢性 ITP患儿外周血为试验组，30 例健康儿童外周血为对照组，用流式细胞术检测外周血 CD3 + T 细胞和 ROS 平均荧光强度，进行统计学分析。结果　试验组CD3 + T细胞ROS平均荧光强度（15.98±5.78）明显高于对照组ROS平均荧光强度（4.65±1.03），两组间 ROS 的差异有统计学意义（t=2.956，P ＜ 0.05）；试验组 CD3 + T 细胞 ROS 与血小板成负性相关关系。结论　慢性ITP 患儿外周血 CD3 + T 细胞的 ROS 明显高于对照组，说明 ROS 可以为儿童慢性 ITP 的诊断及治疗提供一定的参考依据。     

多聚甲醛固定对流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群的影响

摘要：目的?考察多聚甲醛(PFA)浓度和固定时间对流式细胞术检测人外周血T、B、NK淋巴细胞亚群百分比和平均荧光强度的影响。方法?以健康人外周血为研究对象,将六色荧光抗体标记后溶血处理的细胞分别用PBS、1% PFA(10 g/L)和4% PFA(40 g/L)进行重悬或固定,用流式细胞仪在固定0、4、8、12、24、48和72 h后检测CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞百分比,及CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56的平均荧光强度。结果?与PBS对照组相比,72 h内,PFA浓度及固定时间对外周血T、B、NK淋巴细胞亚群百分比均没有影响(P均>0.05);固定8 h内,PBS对各淋巴细胞亚群平均荧光强度均无影响,1% PFA组CD4平均荧光强度下降,4% PFA组CD45、CD3、CD4、CD8平均荧光强度均下降;固定24 h后,各淋巴细胞亚群平均荧光强度均下降,同时4% PFA固定后平均荧光强度均低于1% PFA(P<0.05)。结论?使用流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群,细胞染色后若8 h内检测用PBS进行细胞重悬检测效果最好,PFA固定不应超过12 h,1% PFA固定效果优于4% PFA。     

强直性脊柱炎与HLA-B27的表达及T淋巴细胞亚群和细胞因子相关性分析

目的探讨强直性脊柱炎(AS)与HLA-B27、T淋巴细胞亚群及部分细胞因子之间的相关性,为AS的诊断、治疗及预后提供帮助。方法收集131例AS患者及50例健康人(健康对照组)外周血标本,采用流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞亚群及HLA-B27的表达情况,固相夹心法化学发光免疫量度法对血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子进行定量检测。结果 AS患者与健康对照组比较,CD3+CD4-CD8+T(T8细胞)、IL-8、TNF-α升高,差异有统计学意义(P0.05),CD3+T(总T细胞)、CD3+CD4+CD8-T(T4细胞)、T4/T8、IL-1β、IL-6差异无统计学意义(P0.05)。HLA-B27阳性AS患者和HLA-B27阴性AS患者比较,T淋巴细胞亚群和上述细胞因子间均无显著差异(P0.05)。AS患者HLA-B27不同荧光强度组别间上述各指标均无显著差异(P0.05)。结论 HLA-B27、T淋巴细胞亚群和细胞因子IL-8、TNF-α的检测有助于提高AS诊断敏感性,对判断AS病情的发展转归有一定价值,HLA-B27的荧光表达强弱可能不反映AS病情进展情况。     

通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.     

eNOS基因894G/T多态性与心肌梗死的相关性研究

目的研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因894G/T多态性与新疆维吾尔族人群心肌梗死的相关性。方法选取新疆维吾尔族心肌梗死患者191例和165例对照者,采用Taqman实时荧光定量聚合酶链反应检测eNOS基因894G/T多态性,分析894G/T多态性与新疆维吾尔族人群心肌梗死的关系。结果维吾尔族心肌梗死组及对照组的等位基因频率及各基因型均未发现差异有统计学意义(P>0.05)。结论 eNOS基因894G/T多态性与新疆维吾尔族人群心肌梗死可能无相关性。     

SYBR GreenⅠ熔链曲线分析检测醛糖还原酶C（-106）T单核苷酸多态性

[目的]建立一种单核苷酸多态性检测方法。[方法]用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法结合熔链曲线分析，对醛糖还原酶C(-106)T单核苷酸多态性进行检测和分型。[结果]3例经检测为C／C、C／T和T／T基因型通过测序得到证实。[结论]SYBR Green Ⅰ PCR熔链曲线分析操作简便，结果准确，可作为单核苷酸多态性检测新方法。     

肝细胞肝癌患者外周血调节性T细胞特征性糖基化改变的意义

目的:探讨肝细胞肝癌(HCC)患者调节性T细胞(regulatory T cells,T reg)N-聚糖糖基化改变及其在免疫抑制功能中的作用.方法:采用四色荧光流式细胞仪从HCC患者(研究组,n=32)和健康志愿者(对照组,n=10)外周血单个核细胞中分选CD4+ CD25+ CD127low/-CD49d-T reg;用凝集素芯片检测T reg中提取的细胞膜蛋白.结果:研究组外周T reg胞膜表面较对照组α-1,6-岩藻糖、α-1,6-甘露糖、N-乙酰氨基半乳糖、β型半乳糖链、复杂型N-聚糖增加.结论:T reg特征性聚糖谱改变可能伴随人体免疫功能的改变,这从糖生物学的角度为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点.     

中老年高同型半胱氨酸血症基因多态性与叶酸治疗效果的关联性研究

目的 探讨中老年高同型半胱氨酸血症(HHcy)相关基因多态性与叶酸补充效果的关联性。方法 2020年1~12月于宜宾市第一人民医院确诊的中老年HHcy患者334例,采用问卷收集一般资料,抽取清晨空腹血测定同型半胱氨酸(Hcy)浓度,采用PCR荧光探针法和实时定量荧光PCR(RT-PCR)法检测外周血基因组DNA中MTHFR基因C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和MTRR基因A66G (rs1801394)多态性位点,比较不同情况HHcy患者MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G基因型构成比和等位基因频率。结果 MTHFR基因C677T位点TT型、A1298C位点CC型和MTRR基因A66G位点GG型占比分别为46.7%、16.2和13.5%,rs1801133 T等位基因、rs1801131 C等位基因和rs1801394 G等位基因占比分别为63.3%、29.0%和29.0%。不同居住地、民族和吸烟饮酒史的rs1801131基因型分布比较,差异有统计学意义(P<0.05),不同居住地、BMI及吸烟饮酒史的rs1801394基因型分布比较,差异有统计学意义(P<0.05)。叶酸治疗无效组MTHFR基因T677T和C1298C频率及rs1801133 T等位基因和rs1801131 C等位基因频率高于有效组(P<0.05)。结论 MTHFR的T677T和C1298C患者叶酸治疗效果差。     

无症状神经梅毒患者外周血淋巴细胞亚群检测分析

目的 分析无症状神经梅毒患者外周血中淋巴细胞亚群的变化,从细胞免疫的角度探讨其与无症状神经梅毒发病的关系.方法 分别取健康人(20例,对照组)和无症状神经梅毒患者(14例,试验组)外周血,荧光标记经流式细胞仪检测CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞及CD4 /CD8 比值、CD56 自然杀伤(NK)细胞.结果 无症状神经梅毒患者外周血中的CD3 T无明显改变,CD4 T细胞比例、CD4 /CD8 比值、CD56 NK细胞比例均低于正常对照组(P＜0.05);CD8 T高于正常对照组(P＜0.05).结论 无症状神经梅毒患者细胞免疫功能受抑,其细胞免疫功能失调可能是影响疾病预后的重要因素之一.     

妊娠糖尿病患者外周血γδ T细胞的改变及临床意义

目的比较分析妊娠糖尿病(GDM)患者及健康孕妇外周血中γδ T细胞的组成变化,为探讨γδ T细胞在GDM发病中的作用和意义提供线索。方法采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离GDM患者(病例组)及健康孕妇(对照组)外周血单个核细胞(PBMC),加入荧光标记鼠抗人T细胞抗原抗体(TCR)γδ单克隆抗体(McAb)及鼠抗人CD3 McAb双染,流式细胞术分析γδ T细胞所占比例。结果病例组PBMC中γδ T细胞的比例为(6.89±3.22)%,占CD3+T细胞的(10.87±4.91)%,对照组为(4.26±1.64)%,占CD3+T细胞的(8.21±0.35)%,病例组显著高于对照组,且差异具有统计学意义(P0.05);初诊组GDM患者外周血PBMC中γδ T细胞的比例为(8.79±2.33)%,占CD3+T淋巴细胞的(12.27±5.45)%,显著高于对照组,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论 GDM患者γδ T细胞在外周血PBMC及CD3+T细胞中的比例增高,提示疾病发生影响和改变了T细胞亚群的分布。     

靶向多功能纳米造影剂对肝癌细胞MRI显像和基因传输的研究

目的观察叶酸靶向化聚乙烯亚胺包被的超顺磁性四氧化三铁(Fa-PEI-SPIO)转染Hep3B肝癌细胞的显像效果和基因传输效果。方法 Fa-PEI-SPIO纳米造影剂复合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达质粒后转染肝癌Hep3B细胞。通过激光共聚焦实验检测纳米造影剂的靶向传输效率;通过MRI扫描检测纳米造影剂的显影效果;通过流式细胞术检测纳米造影剂的基因传输效率。结果激光共聚焦实验观察发现Fa-PEI-SPIO/EGFP纳米造影剂可以高效携带荧光分子进入肝癌细胞,转染后细胞中在细胞核的蓝色荧光周围出现大量纳米复合物的绿色荧光。MRI?T2扫描观察发现靶向化纳米造影剂中携带的SPIO发挥了良好的显影效果,转染后肝癌细胞的T2信号明显降低。流式细胞术检测发现,靶向化纳米造影剂明显提高了EGFP真核表达质粒在细胞中的表达效率,表达效率高达(97.72?±?8.23)﹪。结论多功能纳米造影剂Fa-PEI-SPIO可高效负载MRI和荧光造影剂实现对肝癌细胞的高效率敏感显像,并可同时实现目的基因的传输。     

不同转染方法对荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞影响的实验研究

目的:探讨荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的最佳转染方法.方法:以脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照及脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照4种转染方法,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,48 h后以荧光显微镜观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果:脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染效果最好(23.10±2.11%).脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染率分别与脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照法的转染率比较均有显著差异(P<0.01).结论:脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照能显著提高荧光蛋白质粒在人胚肾293T细胞中的转染效果.