多重PCR合成天蚕素基因及其在E.Coli中的克隆

天蚕素抗菌肤是食品领域中研究最多的昆虫抗菌多肤。通过对62种天蚕素低级结构的研究，设计出4条全新抗菌肤序列。应用多重PCR方法合成设计多肤的全基因序列，酶切PCR扩增产物和克隆载体puc19，构建重组质粒并将其转化到大肠杆菌中。测序结果表明目的片段已经成功克隆到宿主菌JM109中。     

抗菌肽基因在E.Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70 bp的DNA片段,用"片段拼凑"的方法通过三步PCR扩增得到目的基因,天蚕素基因被克隆到PUC19载体上,再转化大肠杆菌JM109.电泳分析重组质粒,确定天蚕素基因已转化到JM109上.摇床发酵转化子,IPTG诱导表达目的肽,最后提纯表达产物.SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现,荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致,最后确定天蚕素在JM109中得到表达.抑菌圈活性实验表明,表达肽具有一定抗菌活性.     

抗菌肽天蚕素B对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌作用

目的观察抗菌肽天蚕素B对小鼠铜绿假单胞菌感染创面的抗菌效果。方法于30只ICR小鼠背部切除全层皮肤(创面为1 cm×1 cm),将铜绿假单胞菌菌液涂抹于创面制成感染模型,并随机分为对照组、磺胺米隆组、抗菌肽组,伤后3 h分别用含等渗盐水、100 g／L磺胺米隆溶液、1g／L天蚕素B的纱布湿敷,每组10只。伤后1～4 d对各组小鼠创面行大体观察;伤前和伤后4 d测量体温,抽取血液观察白细胞变化;伤后4 d检测痂下肌肉组织细菌定量和观察存活情况。结果对照组创面分泌物多、创面潮湿;磺胺米隆组、抗菌肽组创面结痂、干燥、无明显分泌物。各组小鼠术后体温多数上升、白细胞计数均减少。抗菌肽组痂下肌肉组织细菌定量为(42±50)集落形成单位(CFU)／g,明显少于磺胺米隆组(886±804)CFU／g(P<0．05),两组均明显低于对照组(41±28)×105CFU／g(P<0．01)。对照组小鼠伤后4 d存活数明显少于抗菌肽组、磺胺米隆组(P<0．05)。结论天蚕素B对ICR小鼠铜绿假单胞菌感染创面有明显的抗感染作用,可明显降低其死亡率。     

乳铁素B的抗菌活性及其影响因素

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽，具有较强抗菌活性．研究表明，乳铁素B对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0．5mg／mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0．4mg／mL；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫酸铵在0～10mg／mL，乳糖、可溶性淀粉在0～4mg／mL，的质量浓度范围内，对乳铁素B的抗菌活性影响不大；当NaCl或KCl的浓度为25～100mmol／L，MgCl2或CaCl2的浓度为1．0～5．0mmol／L时，乳铁素B的抗菌活性就会大大降低；随着缓冲盐浓度和有机酸浓度(25～100mmol／L)的增大，乳铁素B的抗菌活性呈下降趋势，且在微碱性环境下乳铁素B表现出较强的抗菌活力．     

人血管抑制因子vasostatin片段在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性检测

目的：克隆表达人vasostatin片段,纯化目的蛋白并检查活性,以研究人血管抑制因子vasostatin片段的活性区域。方法：重组构建人vasostatin片段和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达。通过GST亲和凝胶纯化目的蛋白,用凝血酶(Thrombin)酶切纯化产物获得单体va- sostatin片段,并采用MTT法检测其抑制内皮细胞增殖活性。结果：表达产物主要以包涵体形式存在,改变诱导条件可增加可溶性表达量,包涵体形式的表达量约占菌体蛋白总量的55%。活性试验表明,各GST-vasostatin片段和vasoatatin片段具有程度不同的抑制bFGF诱导的内皮细胞增殖的活性,其中以片段vasostatin氨基酸135-164的抑制活性最为显著。结论：人vasostatin片段中氨基酸135-164是抑制内皮细胞增殖活性较强的片段。     

抗菌肽葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其活性的初步分析

目的 观察自行设计的葛佬素cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其表达产物的抗菌作用。方法 分析同种族蛋白质Attacin A cDNA序列各种遗传密码子的出现频度，结合已知的葛佬素蛋白质序列，设计、合成其cDNA序列。经测序验证后，将葛佬素基因插入真核细胞表达载体pCDSI中，构建载体pBZHG。随后以脂质体为载体，对COS—7细胞进行质粒pBZHG和空载体pCDSI的转染，72h后收集细胞培养上清液，进行杀菌活性的检测(以正常C0S—7细胞培养上清作对照)。结果 人工设计的葛佬素cDNA序列在COS—7中得到表达。与转染空载体的细胞和正常细胞比较，转染pBZHG的COS—7细胞培养上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性。结论 笔所设计的葛佬素cDNA序列是正确的，由此可为深入研究葛佬素的抗菌及抗内毒素作用提供实验依据。     

砂眼衣原体泌尿生殖器感染及其诊治（附13例报告）

为分析砂眼衣原体泌尿生殖器感染的微生物学特性，寻求其治疗方法，报告１３例砂眼衣原体泌尿生殖器感染，其中３８．４６％并发淋球菌感染。全部经姬姆萨染色、卢戈碘染色检查衣原体包涵体确诊。无北四环素加洁尔阴治愈，分析了砂眼衣原体的微生物学特性，认为其在微生物学中地位介于立克次体与病毒之间，包括原体和始体两种基本结构。并提出溱治疗主要用四环素，总剂量每例２８－５６ｇ，３周为一疗程，有并发症者延长治疗时间。同     

电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质

通过体壁损伤法诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,透析浓缩处理,后经Tricine SDS PAGE得到诱导前后家蝇幼虫血淋巴中蛋白差异表达带,将该条带电泳回收,复性,抗菌活性检测等步骤,分离纯化得到3种抗菌肽:MDL 1、MDL 2、MDL 3.研究结果表明:MDL 1分子中富含Gly,相对分子质量为6200,对革兰氏阴性菌E.coli有较强抗性;MDL 2分子中富含Pro,相对分子质量为11000,对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus均有抗性;MDL 3分子中富含Gly,相对分子质量为14000,对革兰氏阳性菌S.aureus有较强抗性;3种抗菌肽具有很强的温度耐受性,均没有凝血活性和溶血活性.同时电泳制备抗菌肽的实验方法为此类微量生物活性物质的分离纯化提供了有效的途径.     

中药五谷虫粗提物对感染创面抗菌活性的实验研究

目的 探讨中药五谷虫抗菌物质的提纯方法和抗菌活性.方法 对五谷虫虫体进行匀浆并分离提纯.以金葡菌为指示菌,采用平板法对粗提物进行抗菌活性测定;SDS-PAGE分析纯化过程中蛋白质组成的差异.结果 五谷虫抗菌物质粗提物的抑菌圈直径明显大于对照组,抗菌物质提取物的蛋白质总类以小分子量的蛋白质成分为主.结论 五谷虫的抗菌成分为某种具有抗菌活性的小分子量蛋白肽类物质.     

阳离子抗菌肽LL-37及其在脓毒症防治中的研究进展

阳离子抗菌肽包括防御素和cathelicidin两大类家族。hCAP-18／LL-37是迄今发现的存在于人体中唯一的cathelicidin家族成员，基因定位于3p21．3，主要表达于单核细胞、上皮细胞。LL-37是其具有杀菌活性的成分，由37个氨基酸残基组成，具有两亲性α-螺旋结构。体外研究显示，LL-37具有抗菌、中和内毒素、化学趋化、促进血管新生、组织修复等作用。在体研究发现，LL-37不仅能杀灭致病菌，还能抑制由细菌内、外毒素或细胞壁成分诱发的炎症介质的产生和释放，在脓毒症的发生、发展与防治中有着重要作用。