家蚕凋亡蛋白抑制因子(BmIAP)基因真核表达与功能分析

【目的】家蚕Bombyx mori凋亡蛋白抑制因子(BmIAP)是在家蚕中发现的一个凋亡蛋白抑制因子(IAP)。本研究旨在验证家蚕BmIAP蛋白在家蚕细胞内的功能特征,以进一步研究BmIAP在家蚕细胞凋亡中的作用。【方法】对构建的瞬时表达载体PIZ/V5-BmIAP-dsRed,应用脂质体转染家蚕Bm N-SWU1细胞;应用实时荧光定量PCR和Western blot分析BmIAP mRNA及蛋白表达水平;通过150 ng/m L放线菌素D诱导家蚕Bm N-SWU1细胞12,18和24 h,应用免疫荧光及实时荧光定量PCR方法,分析BmIAP瞬时表达与细胞凋亡的关系。【结果】构建的瞬时表达载体PIZ/V5-BmIAP-dsRed能在家蚕Bm N-SWU1细胞表达BmIAP蛋白,其BmIAP mRNA表达水平上调近45倍,融合蛋白约为60 k D;BmIAP基因瞬时表达72 h后,BmIAP能显著抑制放线菌素D诱导12 h时的家蚕Bm N-SWU1细胞凋亡。【结论】BmIAP蛋白在家蚕细胞中能抑制家蚕细胞凋亡,是家蚕的一种凋亡蛋白抑制因子。     

家蚕微孢子虫感染对家蚕海龟蛋白(Bmtutl)基因表达水平的影响

【目的】本研究旨在阐明家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染不同时间对家蚕Bombyx mori幼虫不同组织中家蚕海龟蛋白(Bombyx Turtle, Bmtutl)基因表达水平的影响,为揭示家蚕微孢子虫的侵染机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对家蚕海龟蛋白3种亚型Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810的序列结构特征进行了分析;利用qPCR检测家蚕微孢子虫感染后12, 24, 48, 72, 96和120 h,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因表达水平的变化情况。【结果】家蚕海龟蛋白3种亚型的二级结构均主要由无规则卷曲、α螺旋、β转角和延伸链组成,其中无规则卷曲所占比例最高。但是PredictProtein分析发现,Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810之间的蛋白/多核苷酸结合位点存在较大差异。qPCR结果表明,感染家蚕微孢子虫后,家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的整体表达处于被抑制状态,尤其在脂肪体中最为明显：Bmtutl-519和Bmtutl-810基因的表达在家蚕微孢子虫感染家蚕后的72 h开始受到显著抑制,特别是Bmtutl-519基因,其相对表达水平均不到对照的5.0%。【结论】家蚕海龟蛋白这3种亚型的序列结构特征存在较大差异,家蚕微孢子虫感染在一定程度抑制了家蚕幼虫中肠、血淋巴与脂肪体组织中Bmtutl-464, Bmtutl-519和Bmtutl-810基因尤其是Bmtutl-519的表达。结果说明,与其他两种家蚕海龟蛋白亚型相比,Bmtutl-519蛋白可能在家蚕微孢子虫侵染宿主的过程中起主要作用。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分布在成熟家蚕微孢子虫孢原质中。qRT-PCR结果表明,家蚕微孢子虫感染后6 h时家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3的表达量最高;siRNA抑制NbTre3的表达后,家蚕微孢子虫16S rRNA的转录水平没有明显的变化。【结论】结果提示NbTre3可能在家蚕微孢子虫感染初期的发芽过程中发挥重要的作用。     

家蚕ADP/ATP转运酶(BmANT)抑制BmNPV增殖作用机制研究

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家蚕热休克蛋白60(heatshockprotein60,BmHSP60)具有直接的相互作用。因此,鉴定Bmant基因在BmNPV感染过程中的功能特征,有助于解析杆状病毒劫持宿主细胞因子促进自身增殖复制机制,完善杆状病毒和宿主相互作用网络。【方法】通过结构域预测BmANT蛋白的结构特征,荧光定量PCR分析Bmant基因在BmNPV感染后的变化特征;并过表达BmANT检测其对病毒DNA复制和病毒蛋白表达变化影响;进一步在转录水平分析Bmant和Bmhsp60基因的调控关系;最后通过流式细胞术等技术鉴定Bmant和Bmhsp60基因共同调控BmNPV增殖复制的机制。【结果】SMART软件预测显示BmANT包含3个线粒体载体结构域,BmNPV感染24 h后Bmant基因持续下调表达。过表达Bmant基因能够显著抑制BmNPV DNA的复制和VP39蛋白表达。荧光定量PCR分析显示Bmant和Bmhsp60基因具有相互拮抗作用,能够相互抑制转录。Bmant和Bmhsp60共同过表达分析显示,BmANT和BmHSP60共同作用BmNPV能够抑制病毒的增殖复制。【结论】结果表明,BmANT是一个线粒体载体蛋白,具有显著的抗病毒作用,能够下调Bmhsp60基因表达,并抑制BmNPV增殖复制。     

家蚕微孢子虫丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白serpin基因NbSPN106的鉴定

摘要：【目的】Serpin在病原与宿主互作中起着重要的作用。本研究旨在分析在家蚕微孢子虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白（Serpin）的结构特征,原核克隆表达以及Western blotting检测。【方法】 基于家蚕微孢子虫全基因组序列,同源序列比对搜索获得serpin基因序列。利用在线软件分析基因的序列特征,ClustalX对氨基酸序列进行多重序列比对。构建含有GST标签的pGEX4T1-NbSPN106原核重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达并进行纯化。纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗体,并与家蚕微孢子虫总蛋白进行Western blotting免疫杂交。【结果】比对搜索在家蚕微孢子虫基因组中发现一个新的serpin基因NbSPN106。NbSPN106蛋白序列长度为384 aa,N端具有信号肽,编码一个42 kDa左右的成熟蛋白。多重序列比对说明NbSPN106具有保守的serpin位点,可能具有抑制功能。免疫杂交在家蚕微孢子虫总蛋白检测到一条45 kDa左右的特异条带。【讨论】生物信息学分析以及免疫杂交结果说明在家蚕微孢子虫中存在NbSPN106。这是在微孢子虫中首次报道发现serpin基因。对研究家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作具有一定的参考价值。     

家蚕miRNA Novel-31~*上调溶血素基因的表达

【目的】Novel-31*是在家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,Bm CPV)感染的家蚕中发现的一个差异表达miRNA。本研究旨在验证Novel-31*对其靶基因表达的调控作用,以便进一步研究miRNA及其靶基因在昆虫免疫调节中的作用。【方法】用生物信息学方法预测Novel-31*的靶基因,荧光定量PCR分析Novel-31*及其靶基因在家蚕感染Bm CPV后不同时间点的表达变化;构建miRNA慢病毒表达载体和靶基因慢病毒表达载体,转染293T细胞,同时合成Novel-31*mimics转染家蚕培养细胞Bm N,使用荧光定量PCR检测Novel-31*对靶基因表达的调控作用。【结果】生物信息学方法预测发现,溶血素基因是Novel-31*的靶基因,其结合位点位于溶血素基因的5'UTR区域。荧光定量PCR分析表明,Novel-31*及溶血素基因在感染Bm CPV的家蚕血淋巴细胞中呈现明显的上调表达。荧光定量PCR检测表明,在Novel-31*慢病毒表达载体和溶血素基因5'UTR慢病毒表达载体转染的293T细胞中和在转染Novel-31*mimics的家蚕Bm N细胞中,溶血素基因都上调表达。【结论】溶血素基因是miRNA Novel-31*的靶基因,Novel-31*与溶血素基因5'UTR结合,上调溶血素基因的表达。     

桔小实蝇细胞凋亡基因hid的克隆及不同发育阶段表达分析

【目的】细胞凋亡是一个细胞自动结束生命的过程,也称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）。头部退化缺陷基因 (head involution defective, hid )是昆虫细胞凋亡基因RHG家族的成员,该家族基因通过克服凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins, IAPs）的保护作用来保证PCD的发生。本研究旨在克隆和分析桔小实蝇Bactrocera dorsalis的hid基因,并研究其在各发育阶段的表达情况。【方法】利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇hid基因的cDNA全长序列。利用荧光定量PCR对hid基因在桔小实蝇不同发育阶段的转录水平进行分析。【结果】克隆获得桔小实蝇hid cDNA序列,将其命名为Bdhid (GenBank登录号为KJ461670),其开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸。氨基酸序列分析显示其具有一个短的N-端肽基元( IAP-binding-motif, IBM) 和C-端Grim Helix 3 (GH3) 结构域,与其他已知的双翅目昆虫hid基因有较高的同源性。实时荧光定量PCR检测结果表明,该基因在桔小实蝇的幼虫期表达水平较低,蛹期及成虫期表达量显著升高。【结论】这些结果为进一步研究hid基因在桔小实蝇细胞凋亡途径中的功能及其转基因条件致死品系的获得奠定了基础。     

家蚕Caspase家族基因 BmCaspase-X 的克隆与功能分析

【目的】本研究旨在克隆获得家蚕 Bombyx mori Caspase家族基因,并通过RNAi技术初步分析其在家蚕细胞水平细胞凋亡中的功能。【方法】 用cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆家蚕Caspase家族一个新基因,用RNAi和流式细胞术初步分析该基因在家蚕细胞凋亡中的功能。【结果】将克隆获得的家蚕Caspase家族基因命名为 BmCaspase-X,其全长为2 105 bp,开放阅读框长为1 494 bp,编码497 aa,分子量为57.8 kDa,等电点为5.29。BmCaspase-X含有Caspase特有的结构位点。系统进化分析表明,BmCaspase-X与家蚕ICE同其他昆虫Caspase-4同源物先聚在一起,再与具有长前体结构域的昆虫其他因子聚为一类。RNAi初步结果显示该基因干扰后没有出现明显的细胞凋亡。【结论】BmCaspase-X具有典型Caspase特征,属于Caspase家族成员。目前RNAi实验结果表明 BmCaspase-X 未能引起家蚕细胞凋亡的改变。本文为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

家蚕Bms3a基因真核表达载体的构建及其在家蚕细胞和蚕体中的表达

Bms3a基因可能在家蚕Bombyx mori抗病或细胞凋亡中有一定的作用。将融合有绿色荧光蛋白的Bins3a基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中获得了pFastBac-IE1-Bms3a-EGFP真核表达载体,利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,以重组病毒感染家蚕BmN细胞和五龄幼虫,分别在感染24h和48h检测到有绿色荧光蛋白的表达,Western blot证明表达的融合蛋白在相对分子量约57kD处出现特异条带,与预计的蛋白理论值相符。结果表明BmS3A-EGFP融合蛋白在家蚕细胞BmN及幼虫体中得到高效表达。研究结果为进一步研究BmS3A蛋白的功能奠定了基础。     

hsc70-4基因促进家蚕核型多角体病毒复制增殖

【目的】热休克应答(heatshockresponse,HSR)是机体细胞应对环境压力的一种重要防御策略,鉴定热休克蛋白在杆状病毒侵染宿主过程中的功能,并揭示其作用的分子机制,为探明宿主与病毒相互作用的分子基础提供理论依据。【方法】通过分子克隆技术对Bmhsc70-4基因进行克隆,并利用BioEdit及GeneDoc对其进行多序列比对分析;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对Bmhsc70-4基因进行过表达和敲除;利用荧光定量PCR技术检测相应基因的表达量;通过对Caspase-9和Caspase-3/7活性的检测确定Bmhsc70-4基因对细胞凋亡的影响;通过免疫荧光验证BmHSC70-4和BmIAP的共定位情况,并进一步通过免疫共沉淀验证它们的相互作用。【结果】Bmhsc70-4基因开放阅读框为1950bp,编码649个氨基酸,在昆虫间具有较高的保守性;BmNPV能够诱导Bmhsc70-4基因上调表达,过表达Bmhsc70-4基因能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmhsc70-4基因能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmhsc70-4基因的表达利于BmNPV的增殖;Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能;荧光共定位显示BmHSC70-4和BmIAP共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;BmNPV侵染过程中Bmhsc70-4基因能够促进Bmiap基因的表达。【结论】Bmhsc70-4基因具有抑制家蚕细胞凋亡的功能,在BmNPV侵染家蚕细胞过程中,能够与BmIAP相互作用,并促进BmNPV复制增殖。     

鰤诺卡氏菌对大口黑鲈头肾巨噬细胞的侵染过程

【背景】鱼类诺卡氏菌病潜伏期和病程较长,感染率和死亡率较高,给水产养殖业带来较大的经济损失,其病原鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是胞内寄生菌,侵入细胞后引起慢性感染是主要的致病机制。【目的】构建鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈(Micropterus salmoides)头肾巨噬细胞体外模型,观察鰤诺卡氏菌侵染巨噬细胞的过程并探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【方法】采用密度梯度离心法分离巨噬细胞,通过特异性染色和PCR扩增巨噬细胞表达基因mpeg1对细胞进行鉴定,并通过CCK-8法和氧呼吸暴发活性测定检测巨噬细胞的活性;通过倒置荧光显微镜和流式细胞术观察侵染过程中细菌与细胞的形态与数量变化;通过双荧光流式细胞术检测、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放试验及线粒体膜电位检测,探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【结果】从大口黑鲈头肾分离获得纯度高的巨噬细胞,经染色和PCR法鉴定为巨噬细胞;筛选出最优的体外培养条件为1640培养基+1%青霉素链霉素+1%胎牛血清。在脂多糖刺激后,巨噬细胞的氧呼吸暴发能力显著提高(P<0.05)。GFP-鰤诺卡氏菌侵染细胞2 h后细菌被细胞吞噬,4 h细胞变圆且贴壁率降低,6 h细菌大量繁殖并包围细胞,8 h后细胞大量死亡。凋亡相关实验结果表明,侵染初期巨噬细胞凋亡率增加,LDH释放增加,线粒体膜电位下降;随着侵染时间延长,细胞凋亡率下降、LDH释放量及线粒体膜电位下降减少,说明鰤诺卡氏菌对巨噬细胞起先促进后抑制凋亡的作用。【结论】通过密度梯度离心法成功分离大口黑鲈头肾巨噬细胞,并通过鰤诺卡氏菌侵染细胞后初步摸清鰤诺卡细菌在细胞水平的致病机理,建立了鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈头肾巨噬细胞的体外模型;证实了鰤诺卡氏菌可侵染巨噬细胞并抑制细胞凋亡,从而达到在巨噬细胞内存活,为进一步开展鰤诺卡氏菌与巨噬细胞相互作用并阐明鰤诺卡氏菌的致病机制奠定了研究基础。     

家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶NbHK对家蚕基因表达及相关通路的调控作用

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物,它可以感染几乎所有动物种类,包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosema bombycis hexokinase, NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用和宿主互作蛋白质进行了系统分析,为阐明该蛋白在侵染中的作用与机理提供参考。【方法】利用原核表达蛋白免疫小鼠,制备NbHK的多克隆抗体,并利用Western blotting和间接免疫荧光法分析家蚕微粒子虫在感染的家蚕胚胎细胞(Bombyx mori embryo, BmE)中的表达和定位;通过过表达和RNA干扰实验,分析NbHK对病原增殖的作用;利用RNA-seq分析NbHK调控的家蚕基因表达和通路;利用生物素-链霉亲和素系统和质谱技术,从NbHK::APEX2转基因细胞中分离鉴定NbHK的互作蛋白。【结果】在感染家蚕微粒子虫的BmE中,NbHK持续上调表达,主要被定位于宿主细胞核内。过表达NbHK显著促进了病原增殖,而敲低NbHK则明显抑制了病原增殖,说明在NbHK感染过程中发挥关键作用。利用RNA-seq分析鉴定了94个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中58个基因上调,36个基因下调。DEGs的富集分析显示,细胞寿命和内质网蛋白加工通路受到显著激活,而线粒体自噬途径受到明显抑制。互作蛋白鉴定分析发现,NbHK可能与宿主细胞核内的核蛋白易位启动子区(nucleoprotein translocated promoter region, NTPR)等蛋白间存在相互作用。【结论】NbHK主要被定位至家蚕细胞核中,调控家蚕细胞寿命等多个重要通路的基因表达,以利于病原增殖。本研究为深入解析NbHK在感染过程中的功能及其调控机理提供了新的参考。     

东方蜜蜂微孢子虫N6-腺苷特异性甲基化转移酶基因的克隆、分子特性及表达模式北大核心

【目的】东方蜜蜂微孢子虫(Nosme ceranae)专性侵染成年蜜蜂导致微孢子虫病,给养蜂生产造成很大损失。目前,东方蜜蜂微孢子虫的N6-腺苷特异性甲基化转移酶(N6-adenine-specific methyltransferase,N6AMT)基因NcN6AMT的研究仍然缺失。本研究对NcN6AMT的编码序列(coding sequence,CDS)区进行克隆,并解析NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,进而测定东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂过程中NcN6AMT的相对表达量,以期丰富NcN6AMT的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子虫侵染过程NcN6AMT的功能及表观调控机制提供基础。【方法】采用Protparam和ProtScale软件对NcN6AMT进行等电点和亲水性分析。通过SignalP 5.0、NetPhos 3.1、TMHMM-2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等软件分别预测NcN6AMT的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域、二级结构和三级结构。使用WoLF PSORT II软件预测NcN6AMT的亚细胞定位。根据N6AMT氨基酸序列,通过TBtools软件对智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis ATCC 50506)、蚱蜢脑炎微孢子虫(Encephalitozoon romaleae SJ-2008)、美洲思普雷格孢虫(Spraguea lophii 42_110)、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis CQ1)、隐生菱形藻(Nitzschia inconspicua)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的N6AMT进行结构域预测和分析。利用MEME软件和MEGA 11.0软件进行东方蜜蜂微孢子虫和其他物种N6AMT的保守基序预测及进化树构建。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂过程的相对表达量。【结果】通过PCR扩增出大小约500 bp的目的片段,克隆测序结果显示其与GenBank数据库收录的预测序列一致;NcN6AMT蛋白的分子量约为18.7 kDa,分子式为C845H1374N214O249S6,理论等电点为5.88,脂溶系数是119.76,不稳定系数为37.47,平均亲水系数为0.025,含166个氨基酸和15个磷酸化位点,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核和液泡膜;NcN6AMT含1个甲基转移酶小结构域(methyltransferase small domain,MTS),该结构域同样存在于家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫等8个其他物种的N6AMT;在东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT中均预测到5个相同的保守基序;NcN6AMT与家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、兔脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的N6AMT序列一致性达到70.92%;东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT在系统进化树上聚为一支;东方蜜蜂微孢子虫接种后1–4 d,NcN6AMT在意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂中肠内均呈现先上升后下降的表达趋势。【结论】成功克隆到NcN6AMT基因的CDS区,明确了NcN6AMT蛋白的理化性质和分子特性,并揭示东方蜜蜂微孢子虫和家蚕微孢子虫的N6AMT蛋白具有较高的保守性,NcN6AMT在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂和中华蜜蜂工蜂的第一个增殖周期(1–4 dpi)内动态表达且均呈上升-下降的表达模式。     

荆皮癣湿酊诱导红色毛癣菌凋亡的机制研究北大核心

【目的】本研究旨在探讨复方中药荆皮癣湿酊(Jingpixian tincture,JPXT)对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的凋亡诱导作用,以阐明其可能的抗真菌作用机制。【方法】采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)评价荆皮癣湿酊对红色毛癣菌生长活力的影响;流式细胞仪检测红色毛癣菌细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化;Annexin V-FITC/PI染色荧光显微镜观察红色毛癣菌细胞磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻情况;流式细胞术检测红色毛癣菌细胞凋亡率;FITC-VAD-FMK染色观察红色毛癣菌偏半胱天冬酶(metacaspase)活性;紫外分光光度计测定红色毛癣菌细胞色素C氧化酶的活性。【结果】荆皮癣湿酊处理后的红色毛癣菌细胞活力与MMP水平均有所降低,ROS水平显著升高,PS外翻与凋亡率明显增加,偏半胱天冬酶活性显著升高,细胞色素C氧化酶活性降低。【结论】荆皮癣湿酊可通过诱导菌体凋亡的方式发挥对红色毛癣菌的抗菌作用。     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

毒力基因yqeH功能分析及对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽类急性或亚急性感染,在近年新发现的大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)中,毒力基因yqeH对其致病性的影响尚不明确。【目的】探究yqeH在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yqeH缺失株ΔyqeH及其回复株CΔyqeH,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yqeH对APEC生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验、致病力测定及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平,探究yqeH对APEC感染宿主的影响。【结果】构建了缺失株ΔyqeH和回复株CΔyqeH;生物学特性试验结果表明,与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH生物被膜形成能力、运动能力降低,对酸、碱、渗透压、氧化休克的耐受力降低,抗血清杀菌能力及致病力显著降低;与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH对鸡气管黏膜上皮细胞的黏附及侵袭能...     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将III型效应物（type III secreted effectors,T3SEs）分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端（1–1220 aa）和C端（1221–2030 aa）分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S：：EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。     

甲基营养型芽孢杆菌拮抗玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌及环脂肽分析

【目的】探究甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)对植物病原菌玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis Tehon et Daniels)、链格菌(Alternaria alternate)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的拮抗作用并鉴定抗菌物质,为其病害防治提供优良生防菌。【方法】平板对峙法初筛和杯碟法筛选拮抗菌株;微生物形态学和16S rRNA基因鉴定拮抗菌株;薄层色谱(TLC)和编码基因分析鉴定抗菌物质;玉米田间生防试验评估拮抗菌对3种病原菌的防治效果。【结果】筛选到一株能够明显拮抗玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌的甲基营养型芽孢杆菌B-1841,抑制率分别为65.95%、71.04%和46.69%,抑菌物质为伊枯草菌素类脂肽。玉米田间生防试验表明,菌株B-1841对玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌感染的玉米病害均有防治效果,相对防效分别为60.25%、69.89%和45.21%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌B-1841对玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌引起的病害有防治作用,在农作物真菌病害防治方面具有潜在应用价值。