体内胶原网架生物学转归中碱性成纤维细胞生长因子的表达

摘要 背景：脱细胞真皮基质作为一种新型的真皮替代物,用于组织缺损的修复,但对于脱细胞真皮基质在长期生物学转归过程中碱性成纤维细胞生长因子的表达变化规律,国内外尚未见相关报道。 目的：观察体内胶原网架长期生物学转归中碱性成纤维细胞生长因子的表达变化规律。 方法：选用成年雄性Wistar大鼠21只用于制备脱细胞真皮基质。取84只大鼠,于脊柱左侧作一深至深筋膜表面、面积为2.5 cm×2.5 cm的创口,回植脱细胞真皮基质至成年雄性Wistar大鼠背部皮下,以对侧正常皮肤做对照。于术后3,5,7,10 d,2,3,4,6,8,10周,4,6,8,10个月取材,采用免疫组织化学方法检测碱性成纤维细胞生长因子的表达。 结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子3 d时开始出现阳性表达,并于10 d达到峰值,4周后趋于稳定,8周后各组未见明显变化,与正常皮肤表达一致。提示在脱细胞真皮基质长期的生物学转归过程中,脱细胞真皮基质的改建首先从周边开始逐渐向中央迁移,并于6~8周后改建趋于稳定,被视为自身组织,并参与机体正常组织代谢过程。 关键词：碱性成纤维细胞生长因子;脱细胞真皮基质;吸光度;免疫组织化学;转归 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.020     

含有生肌液的组织工程皮肤修复兔皮肤缺损

背景：在皮肤开放创面上进行缺损修复与重建是组织修复领域的研究焦点。构建含有中药的组织工程皮肤修复创面缺损的研究并不多见。 目的：将含有生肌液的皮肤支架与自体皮肤细胞复合，构建含药组织工程皮肤，修复兔皮肤缺损。 设计：自体对照动物实验。 单位：实验于2005-02/08在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。 材料：同窝大耳白兔8只，体质量1.6~1.8 kg。自行提取生肌液(1 500 g/L)，成分为当归、生地、龟板、象皮、血余、生石膏、炉甘石；明胶-壳聚糖支架材为料天津大学提供，分别修剪成1.3 cm直径的圆片，60Co照射灭菌；DR无细胞真皮基质由江苏省启动市医疗用品研究所提供。 方法：分离培养兔皮肤细胞，获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞。延兔脊柱两侧制作直径1.5 cm的圆形全层皮肤缺损创面4个。分为4组，阴性对照组（明胶-壳聚糖支架贴附于创面后滴加生理盐水），人工真皮组（DR无细胞真皮基质贴附于创面后接种细胞悬液），非含药组织工程皮肤组（明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液），含药组织工程皮肤组（生肌液-明胶-壳聚糖支架贴附于创面后接种细胞悬液）。 主要观察指标：①术后13 d测量剩余创面面积。②术后7 d、10 d取材行组织学与免疫组织化学染色检测。 结果：①术后13 d各组创面面积均有不同程度的缩小，剩余面积阴性对照组>人工真皮组>非含药组织工程皮肤组>含药组织工程皮肤组，非含药组织工程皮肤组、含药组织工程皮肤组与阴性对照组比较差异有显著性意义（P < 0.05)。②术后10 d，阴性对照组、人工真皮组、非含药组织工程皮肤组均有炎性肉芽组织增生，无表皮组织形成；含药组织工程皮肤组形成接近正常的上皮组织及幼稚的真皮组织。非含药组织工程皮肤组与人工真皮组BrdU标记弱阳性，含药组织工程皮肤组BrdU标记强阳性。 结论：实验采用的方法使种子细胞在含有生肌液的明胶-壳聚糖支架上增殖，在体修复皮肤损伤，能够有效扩展皮肤缺损处的覆盖面积，缩短皮肤缺损的愈合时间。     

真皮多能干细胞复合血浆构建真皮再生模版及移植观察

背景：要实现组织工程皮肤生物学功能重建，应从重建功能正常的真皮入手，使之成为汗腺、血管、神经和脂肪再生的场所。 目的：以真皮多能干细胞为种子细胞构建真皮再生模版，观察其移植后的成活状态。 设计、时间及地点：单因素设计，重复观察，于2006-01/06在中山大学眼科中心国家重点实验室和中山大学动物中心进行。 材料：6周龄BALB/c裸鼠10只，由中山大学动物中心提供。人皮肤多能干细胞来源于接受瘢痕整形手术患者的正常皮肤，由汕头大学医学院附属第二医院烧伤整形科提供。人O型血浆为大连制药有限公司产品。 方法：取10 mL人O型血浆，与生理盐水、氨甲环酸混匀后，添加1×105个经5-Brdu标记的人皮肤多能干细胞克隆，振荡致细胞团均匀分布在血浆中，再滴加氯化钙，放置37 ℃培养箱30 min后成凝胶状，然后加入含胎牛血清、B27的DMEM/F12培养液，培养四五天细胞融合成片，吸干凝胶表面水分，使之成膜状，即为真皮模版。裸鼠麻醉后，背部制作全层皮肤缺损创面，然后植入真皮模版，覆盖创面。 主要观察指标：真皮模版移植后观察血管化程度，创面上皮化后免疫组织化学检测模版中5-Brdu标记干细胞的成活状态。 结果：人皮肤多能干细胞在血浆中增殖良好，真皮模版为白色生物膜，厚(500±254)μm，真皮模版中部分细胞仍表达nestin。真皮模版植入后，第3天模版下有少量的血管生成，第9天大量细胞迁入模版中。创面上皮化后第1，3周，皮肤组织的表皮和真皮中均可见大量5-BrdU阳性细胞分布。 结论：人皮肤多能干细胞接种于血浆中构建的真皮模版移植后，能较快血管化，且真皮模版干细胞在受体组织中能成活下来。     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。 目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。 方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。 结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

异体异种脱细胞真皮与自体刃厚皮复合移植的比较

背景：尽管真皮基质的生物模板作用可减少瘢痕形成, 改善创面愈合质量已得到共识,但不同种属脱细胞真皮基质作为真皮添充物的成活机制和重建过程等生物学性能是否有差异仍需进一步探讨。 目的：对比分析异体及异种脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植的近期效果。 设计、时间及地点：随机分组,自身对照观察实验,于2008-01/06在海南省人民医院医学动物实验中心完成。 材料：J-1 型人脱细胞异体真皮基质由北京桀亚莱福生物技术有限公司提供。小型香猪1只以低含量胰蛋白酶消化加反复冻融法制备制备猪脱细胞真皮基质。 方法：选取近交系小型香猪15 只,在每头猪脊背两侧制作6 cm×6 cm全层皮肤缺损创面各3处,共6处,按移植物的不同将创面随机分为3组：猪脱细胞真皮基质与猪刃厚自体皮复合移植组与人脱细胞真皮基质与猪刃厚皮复合移植组在脱细胞真皮基质植入后,在其表面重叠覆盖自体刃厚皮,对照组单纯行猪薄皮片移植。 主要观察指标：移植后9 d、21 d及3个月各组移植物成活情况、创面收缩率和组织学变化。 结果：移植后第9,21天各组移植皮片大部分均成活良好,局部无红肿,3个月时两复合移植组皮肤外观相似,均光滑、柔软、丰满、有弹性,与周围正常组织结合部平坦, 对照组创面收缩凹陷明显,皮片薄弱,韧性也较复合移植组差,3组移植物成活率差异无显著性意义(P > 0.05),自体刃厚皮移植创面收缩率高于其他两组(P < 0.05)。移植后8 d,2个复合移植组脱细胞真皮基质引导形成丰富的毛细血管结构, 复合皮表皮层形成且分化良好;移植后21 d,已有完整的皮肤结构, 真皮层内可见胶原纤维排列规整,表皮-真皮连接区“钉突”结构明显,移植后3个月结构更加接近正常真皮,对照组组织致密,胶原排列紊乱,与瘢痕组织结构相似。 结论：与自体皮复合移植时, 异体及异种脱细胞真皮基质具有相近的生物学性能,且效果优于单纯刃厚自体皮移植。     

丝素蛋白作为真皮替代物移植后的组织学变化

背景：目前国外研究者已研发出多种真皮替代物,取得了一定临床效果,但价格非常昂贵,因此研制和开发经济实用的高质量真皮替代物具有重要意义。 目的：了解以柞蚕丝素蛋白材料为支架构建组织工程真皮替代物移植后的组织学变化,并与聚乙烯醇海绵相比较。 方法：取清洁级雄性SD大鼠,背部制作一大小为20 mm×20 mm 的全层皮肤缺损创面,切下皮肤反取成刃厚皮待用,然后随机分为2组,海绵组：创面埋植聚乙烯醇海绵并覆盖自体表皮。丝素组：创面埋植交联柞蚕丝素多孔材料并覆盖自体表皮。分别于术后5,10,15,25 d取材,观察移植物及其周围组织大体标本和组织形态学变化,免疫组织化学染色增殖细胞核抗原和转化生长因子β1的相对定量分析。 结果与结论：移植术后丝素组复合皮片生长良好、全部存活;海绵组移植皮片大部分变黑、结痂,并有脱落。免疫组织化学结果显示丝素组在术后5~25 d 转化生长因子β1和增殖细胞核抗原的表达均显著大于海绵组。结果提示,以丝素蛋白为支架构建的组织工程真皮替代物具有良好的生物相容性,血管化过程快,并能促进皮肤创面的愈合。     

自制羊膜载体复合物植入表皮细胞修复全层皮肤缺损

摘要 背景：利用组织工程和细胞培养技术研制的复合皮肤距理想的人工皮肤尚有一定的差距,如局部皮肤薄弱、抗拉及抗摩擦能力差、无皮肤附属器等。 目的：观察含碱性成纤维细胞生长因子和维生素C的羊膜载体复合物对皮肤缺损局部真皮组织的修复作用,寻找真皮组织修复重建促进表皮生长的最佳时期。 方法：取新西兰大耳白兔36只,在每只背部建立皮肤全层缺损模型3处,分别植入含有缓释碱性成纤维细胞生长因子和维生素C羊膜载体复合物、单纯羊膜载体复合物及油纱覆盖。随机分为3组,分别于术后21,14,7 d植入自体表皮细胞混合液,1周后行大体、组织学、免疫组织化学、墨汁灌注等观察。 结果与结论：术后21 d植入表皮细胞组皮肤缺损局部新生皮肤瘢痕轻、形态结构较满意,创面愈合速度和质量均优于术后14,7 d 植入表皮细胞组,并且植入含碱性成纤维细胞生长因子和维生素C羊膜载体复合物组创面皮肤新生真皮组织完全被新生的表皮覆盖,而且表皮几乎均变为复层,其生长速度及质量优于单纯羊膜载体复合物移植组和油纱覆盖组。说明含有碱性成纤维细胞生长因子和维生素C的羊膜载体复合物植入皮肤全层缺损后,能加速真皮的修复和重建;真皮组织修复增生晚期和重建初期为促进表皮生长的最佳时期。 关键词：羊膜载体复合物;表皮细胞;碱性成纤维细胞生长因子;皮肤创伤愈合;真皮 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.16.003     

组织工程同种异体脱细胞真皮复合自体刃厚皮微粒皮移植

为观察组织工程同种异体脱细胞真皮复合自体刃厚皮、微粒皮移植的临床应用效果，选择2005-04/2008-06海南省农垦三亚医院烧伤整形科严重烧伤和瘢痕患者8例12个创面，采用脱细胞真皮复合自体刃厚皮片、脱细胞真皮复合自体微粒皮移植修复创面。12创面中，10个创面复合皮完全成活，1个创面出现散在点状坏死,经换药8 d愈合。1例植皮部分成活，经补充游离植皮后创面愈合。随访6~12个月，复合移植皮肤质地柔软，弹性良好，无瘢痕增生，类似全厚皮片。提示采用脱细胞真皮复合自体刃厚皮、微粒皮移植修复严重烧伤创面，疗效满意，没有排斥反应，是理想的治疗方法。     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

异种(猪)无细胞真皮基质的制备及体外生物相容性*

背景：人同种无细胞真皮基质作为一种永久性真皮支架,已成功应用于烧伤创面修复及美容医学等领域,但由于来源有限,限制了其应用。 目的：研制异种(猪)无细胞真皮基质,并对其体外生物相容性进行评价。 设计、时间及地点：体外细胞学对比观察实验,于2007-08/2008-06在中国辐射防护研究院生物材料与制药技术研究所实验室完成。 材料：实验猪由中国辐射防护研究院实验动物中心提供;人成纤维细胞来自武警山西总队医院健康儿童包皮环切术切除的包皮组织。 方法：无菌条件下获取健康小白猪猪皮,用高渗盐溶液-去污剂、胰酶消化及超声清洗的方法,制备猪无细胞真皮基质。体外培养人成纤维细胞,用猪无细胞真皮基质浸提液法及人成纤维细胞和猪无细胞真皮基质直接贴附法,评价猪无细胞真皮基质体外生物相容性。 主要观察指标：①猪无细胞真皮基质的组织学形态。②猪无细胞真皮基质的体外生物相容性。 结果：制备的猪无细胞真皮基质,完全去除了表皮和真皮中的细胞成分,保留了胶原基质。猪无细胞真皮基质浸提液对人成纤维细胞增殖无明显影响。人成纤维细胞可以在猪无细胞真皮基质上贴附、增殖。 结论：此种方法制备的无细胞真皮基质完全去除了表皮和真皮中的细胞成分,有较好的体外生物相容性。 关键词：猪无细胞真皮基质;人成纤维细胞;生物相容性     

三种组织工程鼓膜支架材料的生物相容性

背景：自体组织修复鼓膜穿孔存在增加手术创伤、取材有限等缺点，构建组织工程鼓膜是鼓膜穿孔治疗的发展方向。 目的：构建3种不同材料的组织工程鼓膜支架材料，并评价其生物相容性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，细胞学体内观察，于2004-08/2005-02在解放军第四军医大学组织工程中心完成。 材料：将健康小猪的硬脑膜、真皮及人羊膜进行脱细胞处理。 方法：将预先培养的豚鼠鼓膜成纤维细胞种植于3种材料表面，观察成纤维细胞的生长状态；18只豚鼠随机分为3组，于右侧背皮下分别埋植制备的脱细胞硬脑膜、真皮及人羊膜。 主要观察指标：3种脱细胞生物支架材料的显微结构及组织相容性。 结果：3种脱细胞材料均为网状结构，无任何细胞及细胞残核存在；豚鼠鼓膜成纤维细胞能够很好地贴附于3种脱细胞材料生长，无细胞毒性；将3种组织材料分别埋植于豚鼠皮下后，无埋植材料排出现象，1周时植入材料周围有较明显炎症反应，其中以脱细胞真皮周围组织反应较轻，4周时炎症反应消失。 结论：通过脱细胞方法可以成功建立具有良好生物相容性的组织工程鼓膜支架材料；3种材料中以脱细胞猪真皮的生物相容性最佳。     

重组人白细胞介素10抗家兔同种异体皮肤移植排斥模型的建立

背景：研究表明,白细胞介素10在移植排斥反应的预防和治疗中具有一定的应用前景,有望成为一种新的临床用免疫抑制剂。动物移植模型是研究免疫抑制剂常用的实验平台,最常用的皮肤移植模型动物是小鼠,但小鼠属于小动物模型,移植技术要求较高。 目的：建立家兔同种异体皮肤移植模型,观察重组人白细胞介素10抗家兔皮肤移植排斥反应的效果。 方法：取家兔背部皮肤修剪成含真皮层的全厚皮片、中厚皮片和不含真皮层的薄层皮片进行家兔自体皮肤移植,随机分为固定组和非固定组,固定组用自制脖套对家兔头颈部活动进行一定限制;药物抗家兔同种异体移植排斥设重组人白细胞介素10组、环孢素A阳性对照组和生理盐水阴性对照组。采用混合淋巴细胞反应法观察家兔混合淋巴细胞反应增殖指数。在30 d内连续观察移植皮肤出现排斥的时间和移植皮片平均存活时间。 结果与结论：供、受体混合淋巴细胞培养呈增殖反应,表明家兔同种异体主要组织相容性复合体不同,相互皮肤移植可发生排斥反应。移植皮片厚度以含真皮的中厚皮片为最佳;自制脖套固定可有效限制家兔脖头颈部活动,有利于移植创面的保护。实验成功建立了重组人白细胞介素10抗家兔同种异体皮肤移植排斥模型,重组人白细胞介素10具有抗移植排斥的作用。 关键词：皮肤移植;人白细胞介素10;免疫抑制剂;固定;移植排斥     

未经预处理同种活性生物脱细胞支架的免疫原性及支架张力★

背景：提高生物材料组织相容性的主要办法目前主要采用预处理，但是诸多预处理方法都有缺点，如经预处理后生物组织材料常发生钙化、细胞毒性反应、抗张力强度降低等。 目的：观察未经预处理的生物支架材料的免疫原性、支架张力、细胞生长因子对支架的影响，以及此条件下制备同种活性生物脱细胞支架的方法。 设计：组织形态学层面的对比观察实验。 时间及地点：实验于2006-06/2007-03在南通大学附属医院普通外科完成。 材料：SPF级成年Wistar大鼠。十二烷基硫酸钠为美国BiotechGrade产品；碱性成纤维细胞生长因子,血管内皮生长因子为英国Peprotech Company产品；测力计为苏州电器元件一厂产品。 方法：选取新鲜大鼠下腔静脉作为实验材料，用含十二烷基硫酸钠的Tris低渗缓冲液，以改进的Booth法脱去静脉壁的上皮细胞，固定剂固定后，分别行HE染色、胶原纤维染色的光镜和扫描电镜观察、摄片，并用测力计测量支架在脱细胞前后张力的改变。将支架材料进行同种异体间动物皮下埋置，观察脱细胞支架埋置局部有无红肿等免疫排斥反应。把脱细胞支架结合血管内皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子移植于同种大鼠皮下，2周后采用免疫组化法观察支架内血管的长入情况，使用测力计测量支架在埋置前后张力的改变。 主要观察指标：支架经脱细胞处理和移植入大鼠皮下前后张力的改变。支架内新生血管长入情况。皮下植入的支架局部排斥反应。 结果：用质量浓度为0.03％十二烷基硫酸钠的Tris低渗缓冲液与静脉壁共同孵育48 h后，HE染色、胶原纤维染色的光镜和扫描电镜显示：静脉壁完全脱去了表面的上皮细胞，又较完整地保留了胶原纤维等细胞外基质主要成分：其形态学结构及支架张力在脱细胞前后差异无显著性意义（P > 0.05）。在支架植入部位无明显免疫排斥反应，局部切口愈合良好。支架植入2周后，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能在短期内促进新的血管长入支架内，碱性成纤维细胞生长因子+血管内皮生长因子联合应用后新生血管长入最显著。移植前后支架的张力差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：未经预处理，用含质量浓度为0.03％十二烷基硫酸钠的低渗Tris缓冲液对制备的脱细胞支架在同种异体动物皮下埋置无排斥反应，支架强度无明显变化。碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子可促进新生血管在支架内的生长，并具有协同作用。     

组织工程皮肤移植过程中白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达

背景：白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在异体异种皮肤移植局部免疫与排斥反应中发挥了重要作用。但在组织工程人工皮肤移植过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达情况目前尚不清楚。 目的：采用表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤并移植修复兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果和局部皮肤组织白介素10与肿瘤坏死因子α的表达变化。 方法：将体外培养的人表皮干细胞或角质细胞接种到脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤;取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面随机分为4组,表皮干细胞组、角质细胞组用含表皮干细胞或角质细胞的组织工程皮肤移植于皮肤缺损创面;脱细胞真皮组移植单纯脱细胞真皮;对照组创面空置。观察创面修复情况,局部炎症反应,创面愈合时间。各组分别于术后7d在部分创面取材观察组织形态和白细胞介素10与肿瘤坏死因子α表达。 结果与结论：含表皮干细胞的人工皮肤移植后创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较角质细胞组明显缩短。白细胞介素10在各组均有表达,其中表皮干细胞组表达最强,角质细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组最弱。肿瘤坏死因子α在各组也均有表达,其中角质细胞组表达最强,表皮干细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组较弱。说明以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用有效促进皮肤缺损创面的修复治疗,创面修复过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子的表达变化可能是其取得较好效果的主要机制之一。     

拓扑异构酶Ⅰ在人病理性瘢痕组织中的表达分析

背景：有研究表明,DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)在多种肿瘤细胞内的含量明显高于正常组织。 目的：通过免疫组织化学染色方法比较病理性瘢痕与正常皮肤组织中DNA拓扑异构酶Ⅰ差异。 设计、时间及地点：对比观察,于2005-01/2007-12在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。 材料：人病理性瘢痕组织标本来同期南昌大学第一附属医院手术切取的人病理性瘢痕组织21例,男15例,女6例;同一患者手术多余的正常皮肤组织标本21例作为对照。 方法：对人病理性瘢痕和正常皮肤进行苏木精-伊红染色,鉴定是否为病理性瘢痕和正常皮肤;以免疫组织化学染色检测DNA拓扑异构酶Ⅰ在角质形成细胞和成纤维细胞中的表达。按拓扑异构酶Ⅰ染色阳性细胞占全部细胞的百分比分4个等级：≤5%为阴性(－);6%~24%为弱阳性(+);25%~49%为阳性(++);≥50%为强阳性(+++)。 主要观察指标：人病理性瘢痕和正常皮肤标本拓扑异构酶Ⅰ在角质形成细胞和成纤维细胞中的表达。 结果：拓扑异构酶Ⅰ在人病理性瘢痕和正常皮肤组织的角质形成细胞,成纤维细胞中均有表达。正常皮肤中,角质形成细胞及成纤维细胞各有3例免疫组织化学阳性;病理性瘢痕组织中,角质形成细胞及成纤维细胞各有7例和12例呈阳性。正常皮肤角质形成细胞拓扑异构酶Ⅰ阳性表达率为14.3%,病理性瘢痕组织表达率为33.3%,差异无明显不同(P=0.147 3);正常皮肤成纤维细胞拓扑异构酶Ⅰ阳性表达率为14.3%,病理性瘢痕阳性总表达率为57.1%,存在明显差异(P=0.003 8)。 结论：在病理性瘢痕组织成纤维细胞中,拓扑异构酶Ⅰ的表达明显高于正常皮肤成纤维细胞。     

皮肤全层缺损真皮修复不同阶段对表皮再生的影响

背景：当前组织工程研究多着重表皮干细胞和真皮支架材料的研究,而少有真皮新生速度和真皮修复不同时期组织结构对表皮新生和重建影响的报道。 目的：观察真皮修复过程中对表皮修复和重建的影响以及是否有促进表皮修复速度的最佳阶段。 方法：新西兰大耳白兔10只分别于第0,7,14天在背部制成3个直径约为3 cm的创面,随机分为0,7,14 d组,每组计10个创面,3组创面分别于皮肤全层损伤修复后21,14,7 d植入自体表皮细胞羊膜载体复合膜。7 d后取材,采用大体观察、常规组织学观察(苏木精-伊红染色,Mallory PTAH染色)、Ⅰ型胶原免疫组织化学观察等化学染色动态观察创面愈合情况。 结果与结论：0 d组创面与周边正常有毛皮肤齐平,与周边组织连接明显较7 d组及14 d组紧密,7 d组尚有凹面,而14 d组创面凹陷明显较7 d组大而深,与周边组织分界明显,这表明0 d组皮肤缺损的修复效果明显优于其他2组(P < 0.05)。 0 d组Ⅰ型胶原阳性的成纤维细胞、血管及胶原纤维等组成的真皮网状层和乳头层较其他2组明显(P < 0.05),创面愈合率高(P < 0.05)。真皮修复的不同时期,对表皮再生的促进作用存在不同,全层皮肤缺损处于真皮修复的增生晚期与重建初期是促进表皮新生的最佳阶段。 关键词：表皮再生;羊膜;碱性成纤维生长因子;维生素C;皮肤缺损;皮肤组织工程     

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜**☆

背景：去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活。 目的：试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用。同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成。 材料：新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理。密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞。 方法：用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况。以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组。 主要观察指标：①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况。②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果。 结果：光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层。扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架。免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性。 结论：体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附。 关键词：组织工程心脏瓣膜;细胞外基质;黏附     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景：研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物。 目的：通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤。 方法：日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBlot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构。 结果与结论：传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好。细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性。碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤。     

脱细胞天然骨基质的制备及其移植免疫分析

背景：同种异体骨来源广泛，便于大量加工贮存，如能去除其免疫排斥反应用于骨支架修复骨缺损，将很好地解决骨源问题，但目前去除免疫排斥的方法不尽理想。 目的：为修复骨缺损寻找去除动物骨中的免疫排斥反应方法进而提供理想的骨支架材料。 方法：取大鼠股骨经低渗-脱细胞、过氧化氢处理基质制备天然脱细胞骨支架，再通过苏木素-伊红和甲苯胺蓝染色、扫描电镜与透射电镜观察、有机成分分析、洗脱剂残留量测定和移植免疫分析的方法评估处理效果。 结果与结论：组织学观察可见处理后的脱细胞骨基质中胶原纤维排列规则，骨陷窝空虚，未见细胞，纤维连接蛋白和层黏连蛋白多存留在骨陷窝周边部。扫描电镜观察见处理组骨基质板层连接疏松，板层之间出现大量孔隙；透射电镜见骨陷窝区已无高密度影；高效液相色谱仪检测TritonX-100在脱细胞骨基质中几无残留；淋巴细胞刺激实验表明新鲜骨引起的免疫排斥反应要明显强于脱细胞骨基质（p<0.01）。说明联合应用低渗-脱细胞和过氧化氢处理基质的方法去除免疫排斥反应较为理想，为进一步制备组织工程骨支架材料进行动物移植实验打下基础。     

异种脱细胞真皮替代睑板材料重建眼睑的可行性*☆

摘要 背景：眼睑后层重建是眼睑重建的重点和难点，其中睑板替代物更是研究的焦点。异种脱细胞真皮作为一种新型的组织工程材料，在国内外烧伤整形领域，正得到广泛的研究和应用。 目的：观察异种(猪)脱细胞真皮植入兔眼睑后的组织相容性极其组织病理学变化。 方法：剥取健康小白猪全层皮肤20 cm×20 cm，制备异种(猪)脱细胞真皮基质。同时制备兔睑板全层缺损模型并植入脱细胞真皮基质，观察大体情况，并分别于第1，2，3周取移植交界处眼睑组织光镜下观察组织学的改变。 结果与结论：大体观察未见明显排斥反应及眼睑的变形；光镜下1周时可见局部炎症细胞浸润，2周时炎症细胞减少，3周时正常纤维组织长入，逐渐分割代替植入的胶原纤维，炎症反应消失。提示异种脱细胞真皮免疫原性低，并可引导新生胶原的生长，是一种良好的睑板替代物。 关键词：异种脱细胞真皮；眼睑重建；组织工程；材料；相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.004