中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的 分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素（ADM）诱导的HepG2／ADM细胞的多药耐药性的机制。方法 以亲本细胞HepG2为对照，MTT法观察肝癌-1号对HepG2／ADM细胞的毒性作用；流式细胞仪检测肝癌1号作用后细胞表面p-糖蛋白（P-gp）表达阳性率；逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因（MDR1）mRNA表达水平；MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2／ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果 肝癌-1号〈50μmol／L对HepG2／ADM细胞无明显毒性，半数抑制率（IC50）为75μmol／L；50μmol／L的肝癌-1号可部分抑制HepG2／ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达，可逆转HepG2／ADM的耐药性，对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3．94（P〈0．01），1．72（P〈0．05），1．67（P〈0．05）。结论 肝癌-1号通过抑制HepG2／ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成，能部分逆转HepG2／ADM的耐药性。     

裸鼠原位肝细胞癌多药耐药模型的建立

目的建立裸鼠原位肝癌多药耐药模型。方法分别在开腹直视下将人肝癌细胞系 HepG2和多药耐药细胞系HepG2／ADM两种细胞种植于裸鼠的肝包膜下建立原位肝细胞癌多药耐药动物模型。用B超、剖腹探查检测两组肝脏肿瘤生长情况。利用长链PCR技术对耐药细胞系 HepG2／ADM和相应种植瘤组织MDR1基因全长进行扩增并测序,再分别用RT—PCR、免疫组化、 Western blotting方法检测两组肿瘤耐药基因MDR1mRNA和P—gp蛋白的表达。结果原位肝脏种植肿瘤成瘤率均为100％(30／30),耐药诱导成功率为95％(19／20);用长链PCR技术对耐药细胞系 HepG2／ADM和相应种植瘤组织进行MDR1基因扩增,均能扩增出全长为3．8 Kb的基因条带,双向 DNA测序结果均与Genebank报道一致。耐药组MDR1mRNA和P-gp蛋白的表达均明显高于对照组 (t1=3．72,t2=2．98,P<0．01)。耐药组P-gp蛋白表达为(42．6±1．7)％远高于对照组(2．6± 0．1)％,差异有统计学意义(t=6．43,P<0．01)。结论成功建立肝癌多药耐药动物模型并且为研究肝癌多药耐药逆转提供基础。     

核酶对人肝癌细胞多药耐药性的逆转

目的 利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(MDR1),逆转肿瘤抗药性。方法按照“锤头结构”模型设计、合成了核酶196MDR1(196 RZ),并定向克隆入包含RNA多聚酶Ⅲ启动子的逆转录病毒载体中。通过脂质体介导,将抗mdrl核酶表达质粒(N2A tRNA1^(met)-iMDRl-Rz)导入人肝癌耐药细胞株HepG2。分别采用RT-PCR、荧光PCR、蛋白质印迹分析(western blot)、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及MTT、方法,观察细胞的．RZ、mdrl mRNA、P糖蛋白(Pgp)表达和对化疗药物敏感性的变化。结果经抗MDR1核酶处理的耐药HepG2细胞,RZ稳定表达,MDRl mRNA、Pgp明显降低,细胞内罗丹明聚集,对阿霉素的敏感性提高200倍。结论针对多药耐药基因mdrl的核酶可明显降解mdrl mRNA,抑制Pgp的表达,具有强大的逆转肝癌耐药细胞HepG2多药耐药的作用。     

缺氧诱导因子-1αsiRNA增强耐药肝癌细胞的化疗敏感性

目的 观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）特异性小分子干扰RNA（siRNA）对肝癌化疗的增敏作用。方法 构建HIF-1αsiRNA真核表达质粒，经脂质体稳定转染于耐药的C28肝癌细胞。研究分为实验组、阴性对照组和空白对照组。荧光定量PCR和Western blot技术分别检测3组细胞中多药耐药相关基因MDR1、LRP、MRP1在mRNA和蛋白水平的表达，PI法流式细胞术分析3组细胞在受到5-Fu作用后的凋亡指数。每组细胞分别随机注入10只裸鼠皮下，比较3组细胞成瘤后对ADM治疗的反应性。结果 HIF-1αsiRNA能有效抑制HIF-1α基因的表达，并能使C28耐药肝癌细胞内MDR1、MRP1、LRP基因在mRNA和蛋白水平表达明显下降。在5-Fu作用后第24、48、72小时，实验组细胞的凋亡指数分别是阴性对照组的2．88、3．56和3．87倍，实验组对化疗药物5-Fu的敏感性显著增强（P〈0．01）。注射阿霉素后，实验组裸鼠皮下的耐药肝癌瘤体明显缩小，肿瘤抑制率为41．35％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 成功构建了HIF-1α—siRNA的真核表达质粒。HIF—1α靶序列特异性的siRNA可增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性，它与传统化疗药物的联合应用可望实现对肝癌的有效治疗。     

溴隐亭联合肿瘤坏死因子-α对人肝癌耐药细胞株化疗敏感性的影响

目的 研究溴隐亭联合肿瘤坏死因子-α（TNF—α）基因处理人肝癌耐药细胞株HepG2／ADM后对其化疗敏感性的影响。方法 脂质体转染TNF-α基因至肝癌耐药细胞HepG2／ADM;实验分4组：空白对照组HepG2（A组）、耐药组HepG2／ADM（B组）、转染TNF—α基因组（C组）及联合溴隐亭和TNF—α组（D组）;流式细胞仪检测各组罗丹明123细胞内潴留率变化、四唑盐比色法（MTT）检测C、D两组细胞耐药指数及用免疫组织化学染色、Western blot和RT—PCR方法测定各组PKC-α、P-gP蛋白、MDR1 mRNA表达的变化,流式细胞仪检测Bcl-2蛋白的表达,AnnexinV-FITC,PI双标检测各组肿瘤细胞化疗后凋亡的变化。结果 MTT测定C、D两组之间耐药逆转率有显著差异（P〈0.01）,罗丹明123潴留率实验发现C、D两组均能明显增强其潴留作用且两组差异有统计学意义（P〈0．01）;P-gP蛋白和MDR1基因表达显示C、D两组之间MDR1基因和P—gp蛋白的表达无统计学意义（P〉0．05）,但C、B两组之间比较差异有统计学意义（P〈0．01）;PKC—α蛋白表达在D组明显下调（P〈0．01）;B组细胞Bcl-2蛋白表达明显增强,C、D两组细胞Bcl-2蛋白表达明显下调,与A组比较均有统计学意义（P〈0．01）,但C、D两组细胞Bcl-2蛋白表达无统计学意义（P〉0．05）。细胞凋亡率C、D两组比较有统计学意义（P〈0．01）,D、A两组比较无统计学意义（P〉0．05）。结论 溴隐亭和TNF—α通过不同的机制逆转肿瘤的多药耐药性,两者联合明显加强抗肿瘤药物对细胞的毒力。     

多药耐药基因转染对肝癌小鼠大剂量化疗支持作用

目的观察多药耐药（MDR1）基因保护骨髓进行大剂量化疗杀伤肿瘤及在体内表达情况。方法BALB／C小鼠H22肝癌模型，^60Co-γ照射，移植转染MDR1的骨髓造血细胞后化疗，计数白细胞，测定瘤体大小；外周血、骨髓、脾、肿瘤等行P-糖蛋白免疫组织化学，流式细胞术以及MDR1RT-PCR。PCR检测。结果MDR1转染小鼠白细胞明显较高（P〈0．01），单纯骨髓移植小鼠白细胞前3周高于BC组，第4周后差异无统计学意义；化疗剂量较大抑瘤率高。MDR1转染后肿瘤组织无P-糖蛋白表达；外周血，肾PCR检测有特异条带而RT-PCR检测未发现。结论MDR1保护骨髓支持大剂量化疗可抑制肿瘤生长。外源MDR1仅在骨髓有效表达。     

连续硬膜外阻滞对PIH大鼠FAS/FASL系统及CD4+、CD8+淋巴细胞免疫功能的影响

目的检测连续硬膜外阻滞（LCEB）对妊娠高血压综合征（PIH）大鼠子宫、胎盘FAS／FASL及CD4^＋、CD8^＋细胞的影响，从蛋白和分子水平探讨LCEB对PIH大鼠防治作用的免疫学机制。方法健康雌性Wister大鼠，建立PIH大鼠模型，在其妊娠的第14天随机分四组，每组10只。A组：每日皮下注射L-NAME50mg；B组：行硬膜外腔置管术，不给药，余同A组；C组：行硬膜外腔置管术，每日注入0．125％布比卡因25μl，余同A组；D组：每日皮下注射0．5ml生理盐水。检测子宫、胎盘组织CD4、CD8蛋白及FAS／FAsL mRNA的表达。结果各组在子宫、胎盘CD4与CD8蛋白均有阳性表达；C组与A、B、D组相比CD4的灰度值（AGV）、积分光密度（IOD）、阳性面积百分率（PCP）差异无统计学意义；C组与A、B组相比，CD8的AGV明显降低（P〈0．05），IOD、PCP显著增高（P〈0．05）。C组与A、B组相比，FAS mRNA、FASL mRNA的AGV明显降低（P〈0．05），IOD、PCP显著增高（P〈0．05）；C组与D组相比差异无统计学意义。结论LCEB可以增强PIH大鼠CD8^＋T细胞及FAS／FASL的表达，增强母胎免疫耐受能力。     

胃癌体外药敏试验与多药耐药基因、多药耐药相关蛋白表达的关系

目的 探讨胃癌体外化疗药物敏感试验与胃癌组织中多药耐药基因（MDR1）和多药耐药相关蛋白（MRP）基因表达的关系。方法 收集42例手术切除胃癌标本，采用噻唑蓝（MTT）比色法进行胃癌原代细胞培养体外药物敏感试验，检测其对9种临床常用化疗药物的敏感性，并应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测胃癌组织中MDR1和MRP mRNA表达，分析药敏试验结果与MDR1、MRP mRNA表达的关系。结果42例胃癌组织中MDR1、MRP mRNA表达阳性率分别为38．1％和28．9％。CDDP、ADM和OXA耐药组中，MDR1 mRNA表达阳性率显著高于敏感组；在CDDP和HCPT耐药组中，MRP mRNA表达阳性率显著高于敏感组。结论MDR1和MRP高表达是胃癌对多种化疗药物具有耐药性的标志，结合体外药敏试验，有助于临床筛选有效的化疗药物。     

多药耐药基因在原发性肝癌的表达及其临床意义

目的 探讨多药耐药基因（MDR）在原发性肝癌中的表达及其临床意义。方法 取肝细胞癌标本64例，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法半定量检测肝癌多种多药耐药基因的基因表达情况，分析其临床意义。结果 （1）各多药耐药基因的表达率高，各耐药基因的表达率差异无统计学意义。（2）各多药耐药基因的表达量差异无统计学意义。（3）MDRl、多药耐药相关蛋白（MRP）、谷胱甘肽S转移酶（GST）-π和肺耐药蛋白（LRP）的mRNA表达量有随分级而增高的趋势；DNA拓扑异构酶（TOPOⅡ）的mRNA表达量有随分级而下降的趋势。（4）肝癌MDR基因mRNA表达量与肿瘤大小、有无转移、有无包膜和结节数目有关，与AFP水平、肝硬化情况、肝功能状况无关。（5）在有效组中MDR1、MRP、GST-Ⅱ LRP mRNA的表达量低于无效组；TOPOⅡ mRNA的表达量有效组高于无效组，差异无统计学意义。结论 在肝癌多药耐药基因mRNA的表达率高；在肝癌多药耐药的基因mRNA的表达与肿瘤大小、有无转移、结节数目、有无包膜相关，与化疗的疗效相关。     

电针联合鞘内注射芬太尼对慢性炎性痛大鼠脊髓背角孤啡肽mRNA和脑源性神经营养因子mRNA表达的影响

目的 观察电针联合鞘内注射芬太尼对慢性炎性痛大鼠脊髓背角孤啡肽（OFQ）mRNA及脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA表达的影响，探讨其镇痛机制。方法 鞘内置管成功的成年雌性SD大鼠30只，随机分为5组（n=6）：正常组（A组）、致炎组（B组，大鼠右踝关节腔内注射完全弗氏佐剂50μl）、电针组（C组，大鼠致炎后第4、7、10天电针阳陵泉和足三里，频率2 Hz／100 Hz，强度≤2 mA，30min／次）、芬太尼组（D组，大鼠致炎后第4天开始，连续7 d鞘内注射芬太尼10μl）和针药合用组（E组，针药使用方法同C组、D组）。热板法测定大鼠痛敏分数。于致炎后第11天取L4-6脊髓，采用RT-PCR法检测大鼠脊髓背角OFQ mRNA和BDNF mRNA表达，并采用电泳图像分析系统行半定量分析。结果 与A组相比，B组OFQ mRNA及BDNF mRNA表达升高（P〈0．05）;与B组相比，C组、D组、E组痛敏分数降低（P〈0．05），OFQ mRNA及BDNF mRNA表达降低（P〈0．05）;与C组相比，E组痛敏分数降低（P〈0．05），OFQ mRNA及BDNF mRNA表达降低（P〈0．05）。结论 慢性炎性痛大鼠针药合用的镇痛效果强于单独使用电针，其镇痛机制与抑制OFQ和BDNF在脊髓背角的表达有关。     

短发夹RNA/MDR1逆转肝细胞癌多药耐药

目的 探讨短发夹RNA/MDR1(shRNA/MDR1)干扰技术能否体内逆转肝细胞癌多药耐药.方法 建立肝细胞癌耐药细胞株HepG2/MDR1和敏感细胞株HepG2裸鼠移植瘤模型,分腹腔注射组和瘤体内注射组,以表达载体pSUPER-shRNA/MDR1转染,阴性对照组以阴性载体pSUPER转染,72 h后行腹腔内阿霉素化疗试验,每周2次,共2周,然后处死动物,测量化疗前后肿瘤体积差,瘤体制成细胞悬液和组织切片,分别以流式细胞术和免疫组织化学检测细胞膜P-gp表达.结果 成瘤率100%,HepG2/MDR1组和HepG2组成瘤时间和化疗前肿瘤体积差异无统计学意义,HepG2/MDR1组化疗前后肿瘤体积差(mm3)与阴性对照组比较差异有统计学意义(700.14±25.61比1659.70±152.54,P＜0.01);腹腔注射组和瘤内注射组差异无统计学意义.流式细胞术检测发现治疗组细胞膜蛋白P-gp表达率(%)较阴性对照组明显下调(65.1%比94.1%,P＜0.05),腹腔注射组和瘤内注射组差异无统计学意义(94.1%比92.8%,P＞0.05).瘤体组织病理切片和免疫组织化学分析也有同样的结果.结论 表达载体pSUPER-shRNA/MDR1体内转染可以逆转肝细胞癌多药耐药.     

MDR1启动子调控CD∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建由人MDR1启动子调控CD∷upp融合基因表达的重组腺病毒,为对耐药肿瘤体内外靶向基因治疗奠定基础。方法自行设计一对含XhoⅠ和HindⅢ酶切位点的MDR1引物,从外周血中提取人类基因组DNA,通过PCR扩增MDR1启动子并插入PGL3-enhancer载体上,获得PGL3-MDR1质粒。从PORF-CD∷upp质粒中切下CD∷upp基因,插入PGL3-MDR1中MDR1启动子下游,并从中切下目的基因MDR1-CD∷upp,克隆到腺病毒穿梭质粒中,将带目的基因的穿梭质粒pAdTrack-MDR1-CD∷upp。与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选提取>30 kb的阳性克隆,经线性化后转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增出重组腺病毒中的目的基因MDR1、CD∷upp等方法加以鉴定。结果成功构建了含MDR1-CD∷upp靶向自杀基因的重组腺病毒载体Ad-MDR1-CD∷upp,病毒滴度为3.0×1010pfu/ml。结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其对MDR1耐药细胞系的特异性杀伤作用和对耐药肿瘤模型的靶向基因治疗提供基础。     

MDR基因多态性对肾移植受者环孢素A急性肾毒性发生率的影响

目的 探讨供、受者细胞膜P-糖蛋白(P-gp)的编码基因(MDR基因)多态性对肾移植受者环孢素A(CsA)急性肾毒性发生率的影响.方法 采用聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)方法分析173例肾移植供、受者MDR基因外显子26(exon26)基因型;分别以供者和受者exon26基因型进行分组,观测术后3个月内受者血尿素氮、血肌酐和24 h尿量等指标与供、受者exon26基因型之间的关系.结果 供者和受者exon26基因型均为CC、CT和TT三种类型.173例供者中,CC、CT和TTr型比例分别为:28.3%(49/173)、41.6%(72/173)和30.0%(52/173);173例受者中,CC、CT和TT基因型比例分别为:27.7%(48/173)、40.5%(70/173)和31.8%(55/173).供、受者间exon26基因型的类型和分布比例相似,差异无统计学意义(P>0.05).肾移植术后,共有48例受者符合CsA急性肾毒性诊断标准.按受者CC、CT、TT型分组时,各组受者CsA急性肾毒性的发生率分别为25.0%(12/48)、41.7%(20/48)和33.3%(16/48),各组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);按供者CC、CT和TT基因型分组时,各组受者术后CsA急性肾毒性的发生率分别为14.6%(7/48)、50.0%(24/48)和35.4%(17/48),CC与CT和TT型之间比较,差异有统计学意义(P<0.05).而且.受者CC型组肾功能异常发生率明显高于供者CC型组(P<0.05).结论 MDR基因多态性对肾移植受者CsA急性肾毒性发生率具有明显的影响,而发挥作用是供者MDR基因多态性.     

多药耐药基因MDR1在原发性肝癌组织中表达的意义

肿瘤细胞对化疗药物产生抗药性的原因有几种，其中最主要的是多药耐药基因MDR1。应用免疫组化方法测定30例原发性肝癌（PHC）癌组织和癌周组织中MDR1的表达产物Pgp（P-gly-coprotein，PgP），结果显示，PHC癌组织中MDR1基因表达阳性率（60．0％）远较癌周组织高（23．3％）。化疗后肿瘤组织MDR1阳性率（88．9％）较未化疗瘤的癌组织（47．6％）高。结合临床资料分析，MDR1基因的过度表达在我国PHC的内在性和获得性药物耐受产生中起着一定的作用。关键词:##4多药耐药基因;;原发性肝癌     

瘢痕疙瘩中成纤维细胞耐药基因mdr1的研究

目的 研究瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)与正常皮肤组织成纤维细胞(NF)耐药基因mdr1的表达差异。方法 利用RT-PCR、免疫组化及流式细胞分析等方法,检测瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中成纤维细胞耐药基因mdr1及其蛋白ABCB1的表达;并对30例不同部位瘢痕疙瘩的ABCB1蛋白表达量进行流式细胞分析。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞中耐药基因mdr1及其蛋白ABCB1的表达明显高于正常皮肤;流式细胞分析显示,瘢痕疙瘩原代成纤维细胞中ABCB1表达率:胸部>背部、腹部,差异有统计学意义。结论 瘢痕疙瘩成纤维细胞表达耐药基因mdr1及其蛋白ABCB1,且较正常皮肤中的表达量增高。     

骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较

[目的]探讨诱导分化剂诱导骨肉瘤分化时同骨肉瘤耐药状态产生的分化情况的异同点,以便正确认识分化与耐药相关性。[方法]以诱导分化剂ATRA,IL-4处理人成骨肉瘤细胞系,对比MG-63耐药表型MG-63/R,观察瘤细胞生物学性状。用原位杂交分析在这一转化过程上凋亡调控基因P53,bcl-2 mRNA表达,用Tunel法分析细胞的凋亡。MTT法检查细胞对药物敏感性。[结果]MG-63/R,以及IL-4,ATRA处理的MG-63,细胞均出现分化,AT-RA处理的MG-63表现多药耐药性,并同MG-63/R表现出了相似的特性而IL-4处理的细胞分化的同时并未出现耐药。[结论]肿瘤细胞分化的过程中有可能出现一种顽固的多药耐药的亚分化状态,这种差异性分化的产生可能同细胞种类、状态、药物作用特点及剂量有关,如何控制细胞向耐药状态的分化为肿瘤的治疗提出了新的难题。     

多药耐药基因表达与肾移植急性排斥机制的初步探讨

目的：研究多药耐药基因（MDR1）与肾移植受者急性排斥的关系。方法：用定量RT-PCR技术分别检测14全我急性排斥受者和28例肾功能稳定受者MDR1表达水平，并与36例尿毒症患者比较；14例健康人作为对照组。结果：MDR1阳性表达率急性排斥受者为85.7%。肾功能稳定受者为71.4%。尿毒症患者为44.4%，前二者表达率均高于尿毒症患者，而且急性排斥受者MDR1含量大于肾功能稳定的受者。结论：在肾移植受者中表达增加可能是肾移植受者获得对CsA耐受从而在CsA治疗浓度下发生排斥的机制之一。     

多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达

目的：建立多重逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测肝癌多药耐药（MDR）基因mRNA表达。方法：在对二重RT-PCR扩增5种MDR基因mRNA动力学观察及建立RT-PCR标准曲线的基础上，建立六重RT-PCR方法。结果：六重RT-PCR与单重或二重RT-PCR扩增体系在特异性和扩增效率等方面相同，实验重复性较好。结论：该方法对于检测肝癌组织和肝癌细胞MDR基因mRNA表达具有特异、灵敏、简便、快速（6h）、所需标本量小（5mg）及半定量等优点，能快速同时分析大量样本，具有临床应用前景。