核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价

目的 对不同核酸提取方法在荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）含量中应用进行评价，为临床方法学选择和实验结果的评价提供理论依据。方法 选用直接煮沸裂解法、NP－40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、磁珠核酸提取法等4种核酸提取方法提取乙型肝炎血清标本和含不同含量肝素的血清标本中HBV DNA模板，用荧光实时定量PCR法对其进行准确定量，从提取效率、抗干扰能力方面进行评价。结果 4种核酸提取方法中磁珠核酸提取法提取效率为最高，对数换算后，以此相对提取效率为100％，则直接煮沸裂解法为最低81％（P＜0．05）、NP－40煮沸裂解法为95％（P＞0．05）、沉淀煮沸裂解法为88．7％（P＜0．05）；从抗干扰能力方面，当肝素含量为500U／ml时，磁珠核酸提取法抗干扰能力最强，沉淀煮沸裂解法次之、直接煮沸裂解法和NP－40煮沸裂解法为最差，其HBV DNA含量抑制率分别为9．4％、13．5％、35．4％、52．7％。结论 本实验结果认为磁珠核酸提取法为实验室首选的核酸提取方法。     

不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV—DNA结果的影响

目的 利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸，探讨不同的临床标本和贮存条件对荧光定量PCR法测定乙型肝炎病毒核酸（HBV－NDA）结果的影响，为临床标本的收集和贮存提供依据。方法 按不同要求收集特定的临床标本，用本实验室使用的HBV－DNA提取方法提取DNA模板，再用荧光实时定量PCR法检测HBV－DNA的含量。结果 经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV－DNA的含量无显著性差别均（P＞0．05），但高浓度肝素（1000U／ml)抗凝管结果显著降低（F值为25．96；P＜0．05）；溶血、高血脂标本、标本反复冻融、血浆（清）标本在室温下短期贮存（48h内）对HBV－DNA含量均无明显影响（P＞0．05）。结论 用本实验室使用的HBV－DNA提取方法，可使抗凝剂及其它PCR反应抑制物质对HBV－DNA测定结果影响降到最低，从而使临床无污染标本一般均可接受。     

415例HBV感染的不同血清学指标组合的HBV—DNA的检测

目的 了解HBV感染的不同血清学指标组合的HBV－DNA阳性情况。方法 对415份血清同时行ELISA方法测定HBV－M及普通PCR法检测HBV－DNA。结果 HBsAg( )组HBV－DNA阳性率为77．8％（270，347），HBsAg(-)组HBV－DNA阳性率19．1％（13／68），二者差别显著（P＜0．001）。其中153例HBsAg( )HBeAg( )抗HBc( )血清，HBV－DNA全部阳性，阳性率为100％，HBsAg（ ）抗HBe( ）抗HBc( )组血清HBV－DNA阳性率为66．9％（79／118），HBsAg( )抗HBc( )组血清HBV－DNA阳性率为50％（38／76），抗HBs( )组为18％（9／50），9例抗HBs( )抗HBe（＋）抗HBc( )血清中2例HBV－DNA阳性，2例抗HBs( )抗HBc( ）血清中1例HBV－DNA阳性，4例单一抗HBc( )血清中1例HBV－DNA阳性。结论 单凭HBsAg或HBeAg是否阳性来判断肝脏中HBV复制及有无传染性是不够的，易造成部分慢性乙型病毒性肝炎的漏诊，对HBsAg阴性无论抗HBs是否阳性，只要有HBV感染后的任何血清学依据，都应进一步检测血清HBV－DNA作为诊断乙型肝炎的第二步筛选，有条件时肝活检加以证实。     

144例HBV感染者血清PCR-HBV-DNA与Pre-S_2相关性观察

HBV感染期间，血清HBV－DNA、HBeAg是代表HBV复制的指标．我们应用聚合酶链式反应（PCR）检测了144例乙型肝炎病人血清中HBV－DNA，同时用ELISA法测定了Pre－S：，旨在证实HBeAg、HBV－DNA、Pre－S：三个病毒复制指标的相关性，以了解HBV感染者病毒复制情况．1材料和方法1．1血清标本来源1994年1月～9月我院住院的144例乙型肝炎病人血清．其中52例HBeAg（＋）／抗MBe（－），44例HBeAg（－）／抗一HBe（＋）；48例HBeAg（－）／抗，ute（－）．1．2HBV—M检测ELISA法：试剂盒由上海市传染病医院提供．1．3Pre—…     

HLA-DRB1等位基因与儿童特发性血小板减少性紫癜

目的：研究人类白细胞抗原（LA）DRB1等位基因与儿童特发性血小板减少性紫癜（ITP）的关系。方法：用PCR－SSO法对42例ITP患儿进行HLA－DRB1等位基因分型，同时用改良的血小板抗原单抗特异性固相化法（MAIPA）检测其中36例ITP患儿血清中的抗GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ自身抗体。结果：（1）与健康对照相比，ITP患儿HLA－DRB1＊17基因型显著升高（P＜0．05，RR＝2．76，EF＝0．1064），而HLA－DRB1＊1202基因型显著降低（P＜0．025，RR＝0．20，PF＝0．7616）。（2）慢性难治性ITP患儿与非难治性患儿相比，HLA－DRB1＊11基因型显著升高（P＜0．025），且具有DRB1＊11的患儿主要（5／6）为女性年长患儿；（3）抗GPⅡb/Ⅲa及抗GPⅠb/Ⅸ自身抗体的阳性率都与HLA－DRB1＊02（15／16）基因型显著相关（P分别为0．02和0．01），但难治性和非难治性ITP患儿间抗体阳性差异无显著性（P＞0．1）。结论：（1）DRB1＊17可能与儿童ITP的易感性有关，而DRB1＊1202则可能对儿童ITP的发病具有保护作用；（2）具有DRB1＊11基因型的患儿易发展为慢性难治性ITP；（3）血小板自身抗体与抗原表位的反应可能受DRB1＊02限制，但自身抗体阳性与否并不能预示ITP患儿的预后。     

乙型肝炎病毒前S1抗原和HBV—DNA的相关性分析

目的探讨乙肝病毒前S1抗原与乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV—DNA）的相关性以及前S1抗原检测的临床意义。方法检测381例乙肝患者前S1抗原和HBV—DNA定量。结果132例乙肝表面抗原（HBeAg）阳性患者血清中前S1抗原阳率89．4％，HBV～DNA阳性率91．7％；218例乙肝e抗体（抗－HBe）阳性患者血清中前S1抗原阳性率30．7％，HBV—DNA阳性率27．1％；31例HBeAg和抗－HBe均为阴性，乙肝患者中前S1抗原阳性率38，7％，HBV—DNA阳性率41．9％。前S1抗原与HBV—DNA符合率为92．4％。结论前S1抗原与HBV—DNA符合率较高，可以作为乙肝病毒感染复制的重要指标。     

乙肝抗-HBe及抗-HBs阳转后血清中HBV-DNA的存在状态

由HBV引起的慢性肝炎经抗病毒治疗或自然转归后，用斑点杂交方法和聚合酶链反应（PCR）检测血清中的HBV－DNA。对128名患者进行观察，其中HBeAg阴转者27例，半年、一年后分别用PCR方法检测HBV－DNA,阳性例数分别为20例和18例，阳性率分别是74％和67％（P＞0．1）。而HBsAg阴转两个月后HBV－DNA阳性率为42％，一年后HBV－DNA阳性率为5％。结果表明，血清中的HBV－DNA检测阴性时多伴有抗－HBs出现，其它生化指标也相应改善，而抗－HBe出理时HBV－DNA仍有半数以上阳性。乙肝病毒复制水平HBeAg阴转者明显高于HBsAg阴转者、一般规律是在HBsAg阴转后乙肝病毒复制大部分消失。     

单纯疱疹性角膜炎基因诊断探讨

目的：比较单纯疱疹性角膜炎基因诊断方法。方法：采用角膜拭子和稀释泪液两种取材方法，裂解煮沸法和酚-氯仿法两种DNA提取方法。结果：角膜拭子组中裂解煮沸法的PCR阳性率为73.91％．酚-氯仿法阳性率为39.13％．稀释泪液组中裂解煮沸法阳性率为65.22％．酚-氯仿法阳性率为43.48％.结论：说明两种取材方法对PCR阳性率的影响无显差异、两种DNA提取方法中裂解煮沸明显优于酚-氯仿法。     

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测肿瘤坏死因子β基因多态性

目的：建立酶链反应限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）检测肿瘤坏死因子β（TNFβ）多态性的方法。方法：采用PCR方法扩展TNFβ第一外显子到第二外显子包含G→A突变在内的DNA片段，扩增产物用限制性内切酶Nco I酶切后电泳，分析TNFβ的基因型。结果：TNFβ检测到3种基因型，分别为TNFβ＊1／1、TNFβ＊1／2和TNFβ＊2／2。结论：PCR－RFLP检测肿瘤坏死因子β多态性方法快速、简便、准确、可靠，适合普通实验室开展及大规模研究。     

固相载体法提取病毒性乙型肝炎患者血清DNA的研究

【目的】寻找简单快速地提取血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA的方法.【方法】分别用盐酸胍-硅胶法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV DNA并应用于荧光定量PCR.【结果】盐酸胍-硅胶法所得HBV DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法（P〈0.05）,并且盐酸胍-硅胶法所得结果的重复性优于酚氯仿法和煮沸裂解法（CV分别为0.28,0.31和0.37）.【结论】盐酸胍-硅胶法提取HBV DNA简单、快速且可靠,适用于HBV DNA定量测定.     

HIV-1感染者中HCV混合感染情况分析

目的：调查我国不同地区、通过不同传播途径感染人类获得性免疫缺陷病毒I型（HIV－1）患中丙型肝炎病毒（HCV）的流行情况及不同亚型的分布。方法：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗－HIV－1并以蛋白印迹试验（Western blot,WB)进行确认。采用DNA分支放大（bDNA)技术检测HIV－1病毒载量，采用荧光抗体流式细胞检测技术（FACs)作CD4和CD8细胞计数。抗－HCV检测采用ELISA方法。HCV基因亚型的测定采用实时（real-time)聚合酶链反应（PCR）方法。结果：共检测了239例HIV－1感染，抗－HCV阳性率为56．9％（136／239），其中经不同传播途径感染HCV的阳性率分别为：静脉注毒：42．7％（58／136）；经血液：53．7％（73／136）；性接触途径：3．7％（5／36）。静脉注毒（云南和新疆）HCV感染以1，3，4亚型最多，而输血人群（河南省）感染的HCV以1，2亚型为主。结论：HIV－1感染中存在HCV混合感染，我国HCV基因亚型以1型为主。     

巢式PCR检测外周血血浆和白细胞中人巨细胞病毒核酸

目的比较用巢式PCR检测外周血血浆和白细胞中人巨细胞病毒（HCMV）DNA的阳性率。方法93例外周血标本分离血浆和白细胞，分别提取DNA后进行巢式PCR检测，同时进行荧光定量PCR以及HCMV IgM测定。结果白细胞HCM VDNA检出率为32．3％，明显高于血浆的16．1％（P〈0．017），巢式PCR检测敏感度高于荧光定量PCR（检出率8．6%，P〈0．017）；9例具有系列标本的患者中，用白细胞DNA检测的阳性例数和频度均高于血浆DNA。结论检测HCMV DNA时，以白细胞作为检测材料的阳性率高于血浆，巢式PCR敏感度高于荧光定量PCR。     

乙型肝炎病毒表面大蛋白与HBV DNA检测的对比研究

目的 探讨检测乙型肝炎病毒表面大蛋白（LHBs）用于临床乙型肝炎诊断的实验价值及与乙肝病毒DNA定量的相关性。方法 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和荧光定量PCR法对600例HBeAg阳性血清标本进行LHBs及HBV DNA平行检测。结果 ①在600例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为76．17％（457／600），LHBs的阳性率为77．33％（464／600），二者无显著差异（Х^2=0．696，P〉0．05）；②300份HBeAg阳性血清中，HBV DNA、LHBs阳性率分别为95．0％（285／300）、96．0％（288／300）；300份HBeAg阴性血清中，HBV DNA、IMBs阳性率分别为57．33％（172／300）、58．67％（176／300），二者差异均无统计学意义（Х^2=0．725，P〉0．05；Х^2=0．253，P〉0．05）。③LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关性，相关系数r=0．948。结论 定量检测LHBs有助于了解乙型肝炎病毒复制情况。     

新疆地区献血者HGV和TTV感染的流行病学分析

目的：研究分析庚型肝炎病毒（HV）和输血传播病毒（TTV）在新疆地区献血中的感染状况，方法：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗－HGV IgG、逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术检测HGV RNA，聚合酶链反应（PCR）技术检测TTV RNA，对1997年维吾尔族献血和321名汉族献血的血清标本进行了检测分析。结果：518名研究对象中抗－HBV IgG的阳性检险率为6．5％（34／518）。维吾尔族和汉族血抗－HBV IgG阳性率分别为11．2％（22／197）和3．7％（12／321），X^2=10．9，P＜0．005，维吾尔族有偿献血，无偿献血抗－HBV IgG阳性率分别为13．5％（21／156）、2．4％（1／41），X^2＝4．0，P＜0．05；汉族有偿献血、无偿献血抗－HGV IgG阳性率分别为7．5％（8／106）和1．9％（4／215），X^2＝6．4，P＜0．05，维吾尔族和汉族抗－HGV阳性献血HGV RNA阳性率分别为77．3％（17／22）和66．7％（8／12），X^2=0．5，P＞0．05。维吾尔族和汉族献血TTV DNA阳性率分别为25．7％（9／35）和13．0％（6／46），X^2＝2．1，P＞0．05，抗－HGV阳性和阴性献血中TTV DNA阳性率分别为35．3％（12／34）和14．0％（7／50），X^2=5．2，P＜0．05。结论：新疆地区存在HGV和TTV感染，有偿献血为HGV感染的高危人群，抗－HGV阳性献血有更高的TTV DNA检出率，这种重叠感染的机制有待进一步研究分析。     

裂解液加热煮沸法在血清HBV DNA抽提中的应用

目的建立裂解液加热煮沸法抽提血液HBV DNA的方法。方法选取浓度分别为10^6、10^5、10^4、10^3copies/ml的HBV DNA阳性血清,采用5种方法抽提HBV DNA,并用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测抽提产物。结果在HBV DNA浓度为10^6、10^5、10^4copies/ml时5种抽提法（异硫氰酸胍加热煮沸/盐酸胍加热煮沸/kit/SDS加热煮沸/chelex-100加热煮沸）均能得到阳性结果,而在HBV DNA为低浓度10^3copies/ml时,只有异硫氰酸胍加热煮沸/盐酸胍加热煮沸/chelex-100加热煮沸能得到阳性结果。结论chelex-100裂解液加热煮沸抽提HBV DNA操作简便、省时、经济,为血液标本HBV基因检测在临床上的大规模应用奠定基础。     

O型孕妇血清IgG抗AB效价测定的临床意义

目的对夫妻血型不合的O型孕妇进行血清IgG抗AB效价测定并初步探讨其临床意义。方法采用2-me裂解-37℃吸收-56℃释放-微柱凝胶法分别检测O型男性献血员血清和不同胎次孕妇的血清IgG抗AB效价。结果O型男性献血员血清IgG抗AB总阳性率为18．3％（11／60），且IgG抗A或抗B效价小于512者血清中均未检到IgG抗AB；孕妇组的总阳性率为52．8％（38／72），其中第一胎孕妇血清IgG抗AB阳性率为47．4％（18／38），非第一胎孕妇血清IgG抗AB阳性率为58．8％（20／34）。统计学结果表明，孕妇组与献血员组的IgG抗AB阳性率有显著性差异（P〈0．01）。结论IgG抗AB与妊娠可能密切相关，胎母血型不合的妊娠（包括流产），可能会导致O型孕妇血清IgG抗AB效价升高。通过IgG抗AB效价的动态测定有望对新生儿溶血病或者胎儿血型进行预测。     

提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略

目的：提高乙型肝炎病毒（HBV）DNA P基因区聚合酶链反应（PCR）检测的阳性率。方法：采用优化PCR反应条件，降低退火温度以及采用3'末端碱基游移兼并引物，减少引物与模板引物结合区的错配对PCR的影响等多种方法，对常规PCR检测HBV DNA P基因区阴性的病人血清，再进行PCR检测。结果：通过降低退火温度及减少3'末端错配，PCR检测阳性率由81．7％（67／82）增加至92．7％（76／82，P＜0．05）。结论：综合采用优化PCR反应条件，降低退火温度和采用3'末端碱基游移兼并引物等方法，可提高基因高突变区PCR检测阳性率。     

简易痰处理和DNA提取法PCR扩增123bp检测结核菌

多聚或涟式反应（PCR）技术自1985年由美国Cetus公司人类遗传部创建，1989年Brisson－Neel首次成功地应用于结核病临床标本检测，国内于1990年后陆续开展了该项研究。为了使现有的PCR技术更便于结核病临床应用，我们进行了简易痰处理，简易DNA抽提，二温循环，国产DNA扩增仪扩增123bP检测临床标本结核菌的探讨。1材料和方法1．1材料1．1．1扩增仪：上海复生生物工程研究所研制的FS－318型DNA扩增仪。1．1．2PCR试剂盒：上海复旦大学遗传研究所提供，引物，5'—CCTTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’；引物α5’－CTCGTCCAGCGCC…     

沉淀煮沸裂解法煮沸时间对乙型肝炎病毒DNA检测结果的影响

目的探讨沉淀煮沸裂解法中的煮沸时间对实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎病毒DNA结果的影响,规范试验操作。方法采用沉淀煮沸裂解法提取乙型病毒性肝炎(以下简称乙型肝炎)DNA,煮沸时间为5、7、9、10、11、13、15min,实时荧光定量PCR技术检测乙型肝炎DNA,比较不同煮沸时间检测乙肝DNA的结果。结果煮沸时间在(10±5)min内检测乙肝DNA的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉淀煮沸裂解法中的煮沸时间煮沸时间在一定范围内对乙型肝炎DNA检测结果无影响。     

HBV血清标志物与前S1抗原、HBV-DNA的相关性研究

目的了解HBV血清标志物（HBVM）与前S1抗原、HBVDNA检测的相关性。方法采用ELISA法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAB、HBcAB、前S1抗原。采用PCR法检测HBV—DNA。结果306例HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HbcAb（＋）患者组中的前S1抗原阳性率为91．2％。HBVI）NA阳性率为94．4％；158例HBsAg（＋）、HBeAB（＋）、HBcAb（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为32．9％，HBV—DNABIt性率为31．6％；57例HBsAb（＋）、HBeAB（＋）、HBcAb（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为3．5％，HBV—DNA阳性率为5．3％；21例HBsAg（＋）、HBeAg（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为100．0％，HBV~DNA阳性率为100．0％；124例HBsAg（＋）、HBcAB（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为41．9％，HBuI）NA阳性率为29．0％（P〈0．05）；87例HBsAb（＋）、HBcAb（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为1．2％，HBV—DNA阳性率为1．2％；32例HBeAb（＋）、HBcAb（＋）患者组中的前S1抗原阳性率为9．4％，HBVDNA阳性率为3．1％（P〈0．05）；92例HBcAb（＋）患者组中的前s1抗原阳性率为1．1％，HBV-DNA阳性率为1．1％；103例正常人组中二者均未检出。结论前S1抗原与HBV-DNA、HBsAg、HBeAg阳性呈高度相关，在防治中应引起重视。