多头带绦虫Tm16基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm16重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增Tm16基因,将扩增产物亚克隆入pET32a(+)载体中,构建pET32a-Tm16表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm16重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,多头带绦虫Tm16基因序列长569bp,包括1个399bp的开放阅读框,与已报道的Tm16基因(序列号:EF672036)的序列同源性为99.8%。表达的重组蛋白大小约为30.69ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫1周后血清中即可检测到抗Tm16蛋白的特异性抗体,并于免疫后第5周达到高峰。结果表明Tm16重组蛋白具有较好的免疫原性,可作为脑多头蚴病疫苗的候选抗原。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

内江猪IL-15基因的表达与免疫增强作用研究

参照GenBank中猪IL-15基因的mRNA序列设计1对特异性引物,从经由刀豆蛋白A诱导培养的内江猪外周血淋巴细胞扩增猪IL-15基因;构建其成熟肽原核表达载体pMAL-pIL-15,在Rosetta(DE3)pLysS中表达;构建其真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合免疫雌性BALB/c小鼠以研究其免疫增强作用.测序结果显示,内江猪IL-15基因与发表的猪IL-15基因的核苷酸同源性为97%～99%,含489 bp的完整开放阅读框.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白约为52.5 ku,约占菌体总蛋白的27%.Western-blot检测显示,所表达的融合蛋白为麦芽糖结合蛋白的融合蛋白.MTT法试验证实,该融合表达产物经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖;小鼠免疫试验显示,pCI-pIL～15能够促进小鼠脾CD4+、CD8+T细胞增殖,加强PRV-gD基因疫苗特异性中和抗体的产生.     

马链球菌兽疫亚种串联表达蛋白对小鼠免疫效果的评价

根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)、纤维结合素结合蛋白(FNZ)、IgG结合蛋白(ZAG)的基因序列,分别设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246的基因组为模板,扩增szp(527~1 044bp)、fnz(1 012~1 519bp)、zag(134~664bp)基因序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-szp、pET-32a(+)-fnz、pET-32a(+)-zag。确定诱导表达的三种蛋白都具有免疫原性后,通过PCR串联的方法,将以上3个目的片段同时串联克隆到表达载体pET-32a(+)中。重组质粒转化入大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达分子质量约为74ku的串联融合蛋白SzP-FNZ-ZAG。免疫印迹分析结果表明,上述融合蛋白能够与ATCC35246鼠源多克隆抗体发生结合反应。分别用纯化的单个蛋白和串联重组蛋白免疫ICR小鼠,能够诱导免疫小鼠产生较高效价的血清抗体,串联重组蛋白对致死剂量的马链球菌兽疫亚种强毒菌株的攻击具有90%的免疫保护率,显著高于单个蛋白。RT-PCR检测显示,免疫小鼠IL-4、IFN-γ基因的转录水平显著高于空白对照组小鼠。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪ISG15基因的克隆表达与多克隆抗体的制备

本研究从家猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出家猪ISG 15基因,经测序和序列分析,将ISG 15片段与p ET28a质粒连接,构建重组原核表达载体p ET28a-ISG15;经IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,以获得ISG15蛋白。用纯化的ISG15蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果显示,家猪ISG 15基因CD S区长504 bp,编码167个氨基酸,包括两个泛素样结构域(N端第3~75位和C端第81~156位氨基酸肽段)及C末端保守序列为LRLRGG;W estern-blot分析表明重组ISG15蛋白的免疫原性良好;经ELISA测定血清中抗体的效价为1∶102 400。上述研究结果为进一步揭示家猪ISG15蛋白的功能奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌IbeB重组蛋白诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力

为了研究猪多杀性巴氏杆菌IbeB重组蛋白(rIbeB)的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌ibeB基因序列设计1对引物扩增ibeB基因,并重组至pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-ibeB,转化到大肠杆菌BL21(D E3),经IPTG诱导获得rIbeB。生物信息学分析表明,猪多杀性巴氏杆菌ibeB基因长1 392 bp,编码蛋白质含463个氨基酸。该蛋白质的理论分子质量为51.98 ku,具有2个外排蛋白结构域,属外膜外排蛋白超家族。蛋白序列比对发现,不同血清型的多杀性巴氏杆菌IbeB的同源性达99%以上。rIbeB诱导小鼠的免疫保护结果表明,第3次免疫后第14天小鼠血清中IgG抗体水平显著升高,明显高于佐剂对照组。攻毒后,对照组小鼠第3天的存活率为20%,7 d后全部死亡;免疫组第3天的存活率达70%,第7天的存活率为40%。结果表明,rIbeB蛋白具有很好的免疫原性,可诱导小鼠产生部分免疫保护力。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

鸡Toll样受体3胞外区片段的克隆表达及多克隆抗体的制备

以笔者所在课题组扩增测序的广西三黄鸡Toll样受体3(TLR3)基因为基础,采用降落PCR法从鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外功能区片段chTLR3-LRR,并构建该片段的原核表达重组质粒,通过优化蛋白表达条件,用获得的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,该片段长度为834bp,与预测的片段大小、碱基序列相符;构建的原核表达重组质粒pET-chTLR3-LRR经IPTG诱导后,表达出预期的30ku的重组蛋白,所获得的鼠抗鸡TLR3多克隆抗体能够与经传染性法氏囊炎病毒(IBDV)刺激后的鸡胚成纤维细胞的TLR3蛋白发生特异性免疫反应。表明,所选择的区域片段具有很好的免疫原性,制备的鼠抗鸡TLR3多抗具有良好的特异性,这为进一步研究鸡TLR3的功能提供了重要材料。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55 ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。     

阿苯达唑对猪体内囊尾蚴能量代谢酶活性的影响

测定了在阿苯达唑作用下猪体内囊尾蚴磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)、丙酮酸激酶 (PK)、延胡索酸还原酶 (FR)、异柠檬酸脱氢酶 (ICD)、苹果酸脱氢酶 (ME)活性的变化。结果表明 ,阿苯达唑可显著改变未成熟期及成熟期猪囊尾蚴的能量代谢。提示 ,阿苯达唑的作用机理可能是通过干扰虫体能量代谢 ,阻断能量的产生导致虫体死亡的。     

鹅Ⅰ型禽副黏病毒F基因重组质粒的构建及其DNA免疫

通过RT PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97 1株F蛋白基因的cDNA ,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上 ,构建这一基因的真核表达质粒pC GPMVF ,以此质粒肌肉注射 3周龄非免疫鸡 ,并分别于免疫后第 2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明 ,用重组质粒pC GPMVF免疫鸡 ,能刺激机体产生抗Ⅰ型禽副黏病毒的特异性抗体和免疫应答     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。