淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒核蛋白合成基因的表达及应用

目的 用合成基因表达产物取代淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（ＬＣＭＶ）或其他方法重组蛋白抗原, 用于ＬＣＭＶ感染的诊断。方法 采用Ｐｒｏｓｉｓ软Ｓ件对ＬＣＭＶ核蛋白（Ｎｐ）全长氨基酸序列进行亲疏水性分析,合成ＬＣ－ ＭＶ ｓＲＮＡ第１８１６－２１７８位核苷酸序列编码的Ｎｐ第３８０～５００位氨基酸基因,克隆在Ｈｉｓ－ｔａｇ ｐＥＴ－２８ａ融合表达,表 达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,建立ＥＬＩＳＡ检测试剂。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,表达量 达２０％以上。表达产物经Ｎｉ－ＮＴＡ－Ａｇａｒｏｓｅ纯化后纯度达到９０％以上。经检测９３份人血清．有６份病毒抗体阳 性,阳性率为６．５％（６／９３）,与全病毒抗原检测结果７．５％（７／９３）相近。结论 用合成基因表达产物取代ＬＣＭＶ抗原 检测病毒抗体,不仅可以消除病毒传播可能,而且特异性强。为ＬＣＭＶ感染诊断及生物材料质量控制提供有效方 法。     

观测日全食发现的元素——“太阳”—氦

观测日全食发现的元素“太阳”──氦叶蕊ＥＬＥＭＥＮＴＷＡＳＤＩＳＣＯＶＥＲＥＤＢＹＯＢＳＥＲＶＩＮＧＴＨＥＴＯＴＡＬＳＯＬＡＲＥＣＬＩＰＳＥ＂ＨＥＬＩＯＳ＂－ＨＥＬＩＵＭ日全食是难得的天象奇观。１８６８年，法国天文学家严森［１］特地赶到印度观测研究８...     

牛血超氧化物歧化酶的纯化

比较了几种初步纯化超氧化物歧化酶方法,并进行了优化组合。研究了用软基质阴离子交换柱（ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ）和凝胶柱（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）分离纯化ＳＯＤ的工艺条件。利用建立的方法纯化了来自牛血的超氧化物歧化酶,整个工艺过程总活性回收率为６５％。比活为５４２３ｕ／ｍｇ,纯化倍数提高至６１．６倍。     

非线性本构关系的确立及莫工程设计应用（续）

非线性本构关系的确立及莫工程设计应用（续）袁龙江（天津城市建设学院３００３８１）ＴＨＥＥＳＴＡＢＬＩＳＨＭＥＮＴＯＦＮＯＮＬＩＮＥＡＲＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＶＥＲＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰＡＮＤＩＴＳＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧＤＥＳＩ...     

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的　为了获得大量重组人血管内皮细胞生长因子（ Ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ, ｈＶＥＧＦ）,以研究其在心血管和药学领域具有的潜在药用价值。方法　用ＰＣＲ方法扩增目的基因ｈＶＥＧＦ１６５,连接到 ｐＥＴ－３ａ载体上,并转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,建立可高效表达的ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ１６５重组质粒,经ＩＰＴＧ诱导表达, Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表达产物的抗原性,通过 Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子层析和ＦＰＬＧ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２分子筛柱层析,进行初步纯化,用 ＭＴＴ法检测其生物学活性。结果 　ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ表达产物经纯化后,其纯度可达到９０％以上,表达的ｒｈＥＶＧＦ１６５能 呈剂量依赖性地促进人静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖。结论组建了天然形式ｈＥＶＧＦ１６５的大肠杆菌菌株,并摸索 出一套纯化工艺,为大规模生产重组ｈＥＶＧＦ１６５奠定了基础。     

从精浆前列腺特异抗原的分离纯化及鉴定

用ＰＥＧ－ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０两步法，从精浆中分离纯化前列腺特异抗原（ＰＳＡ）。精浆标本先经ＰＥＧ粗提，约去除８０％的杂蛋白，再经柱层析，进一步提纯，提纯产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＥＬＩＳＡ法证实为免疫纯。     

人热休克蛋白73的基因重组、表达和纯化

目的　用基因重组的方法表达人热休克蛋白７３,并纯化表达产物,用于进一步分析。方法　用人 热休克类似蛋白ＨＳＰ７３基因构建原核细胞表达载体ｐＥＴＨＳＰ７３,在大肠杆菌ＢＬ２１中用半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达,用 电泳法和 ＡＴＰ亲和层析法提取 ＨＳＰ７３。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、用３ ａ３抗体 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ作 ＥＣＬ检测。结果人 ＨＳＰ７３基因 构建的载体ｐＥＴＨＳＰ７３能很好地在大肠杆菌表达出相对分子质量为７３　０００的蛋白。两种蛋白提取方法均能有效提纯表达的蛋白,该蛋白具有人ＨＳＰ７３抗原特性。所得蛋白质氨基酸测定和Ｎ端测序的结果与有关的报道一致。结 论　ＨＳＰ７３基因重组、表达和纯化方法的建立,为研究ＨＳＰ７３的结构、功能与临床应用提供了必要条件。     

LARGE SCALE PURIFICATION OF PHOSPHOGLYCERATE KINASE（PGK） AND GLYCERALDEHYDE 3－PHOSPHATE DEHYDROGENASE（GAPDH） FROMYELLOW PEAS BY PEG／REPPAL PES AQUEOUS TWO PHASE SYSTEM AND ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

ＬＡＲＧＥＳＣＡＬＥＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＨＯＳＰＨＯＧＬＹＣＥＲＡＴＥＫＩＮＡＳＥ（ＰＧＫ）ＡＮＤＧＬＹＣＥＲＡＬＤＥＨＹＤＥ３－ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ（ＧＡＰＤＨ）ＦＲＯＭＹＥＬＬＯＷＰＥＡＳＢＹＰＥＧ／ＲＥＰＰＡＬ...     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

2000年我国合成树脂展望

本文以最新的情报信息资料，全面地，系统地综述了我国１９９０－２０００年合成树脂ＬＤＰＥ，ＬＬＤＰＥ，ＨＤＰＥ，ＥＶＡ，ＣＰＥ，ＰＰ，ＰＶＣ（含ＰＶＤＣ），ＰＳ（ＧＰＰＳ，ＨＩＰＳ，ＥＰＳ），ＡＢＳ，ＡＣＳ，ＭＢＳ，ＳＢＳ等发展情况，新建装置，生产能力；近年来开发成功的新产品，特性及应用；并对合成树脂发展予以展望。     

丙型肝炎病毒E2抗原基因的克隆、表达及纯化

目的　为了获得大量重组HCVE2蛋白 ,以研究E2抗体潜在的保护作用。方法　利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出 931bp的E2基因片段 ,经EcoRI和Sall双酶切后连接到pET 2 8a表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株 ,得到重组质粒PET -E2 ,工程菌经IPTG诱导培养 ,明显表达出HCVE2蛋白 ,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化 ,用ELISA方法检测生物学活性。结果　表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量达菌体蛋白的 18%以上 ,目的蛋白具有良好的反应原性。结论　HCVE2基因的克隆与表达为进一步开展HCVE2蛋白和疫苗研究奠定了基础     

百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用

目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。     

人胎盘泌乳素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人胎盘泌乳素(Human placenta lactogen,hPL)。方法从正常产妇新鲜胎盘组织中提取组织总RNA,PCR扩增hPL基因,将其亚克隆至pQE-30载体,构建重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌M15(pREP4),经IPTG诱导表达。表达产物经Sephacryl S-200层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和western blot鉴定其纯度和特异性。结果重组菌pQE-hPL/M15(pREP4)经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的67%;纯化后目的蛋白纯度可达90%以上;纯化蛋白和hPL包涵体均可与羊抗hPL多克隆抗体特异性结合,具有较强的特异性和抗原性。结论已成功制备了纯度较高的hPL蛋白,为基因工程制备抗体提供了抗原。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。     

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。     

b型流感嗜血杆菌D蛋白的原核表达及纯化

目的克隆b型流感嗜血杆菌(Haemophlilus influenza type b,Hib)D蛋白(hpd)基因,原核表达并纯化重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定基础。方法从Hib CMCC株基因组DNA中PCR扩增hpd基因片段,克隆入载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-hpd,转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6 mol/L尿素变性、DEAE阴离子交换柱纯化、透析复性后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组表达质粒pET-30a-hpd经PCR及测序证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;经一步过柱纯化可得到纯度达95%左右的重组蛋白;纯化的重组蛋白可与Hib免疫小鼠制备的抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了Hib hpd基因,并在大肠杆菌中表达了重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白的高效表达及纯化

用新型表达载体PGEX4T－2在大肠杆菌内高效表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。所表达的核心蛋白融合有谷优甘肽转移酶，用Sepharose4B—GSH凝胶一步亲和层析纯化即可获得高纯度的核心蛋白、该蛋白具有较好的抗原性和特异性。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。