番石榴SRAP反应体系的建立与正交优化

采用正交设计方法,对影响番石榴SRAP反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行了优化,建立了适用于番石榴的SRAP反应体系。该优化的20 μL反应体系中包含2.5 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,1.5 U Taq DNA聚合酶和20 ng模板DNA。利用该优化体系通过64对SRAP引物组合对5份番石榴材料进行了SRAP-PCR扩增,结果表明SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于番石榴种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

油葵SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为建立油葵SRAP-PCR的反应体系,采用单因素试验法,对Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA分别设置5~7个水平梯度,筛选出适宜的用量范围,以此为基础,再通过L16(45)正交试验设计,对影响SRAP-PCR的5个因素进行优化,建立了油葵SRAP-PCR的最佳反应体系：20 μL体系中含10×Buffer 2 μL,Mg2+ 2.75 mmol/L,dNTPs 0.18 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,正反引物各0.3 μmol/L,模板DNA 60 ng,最佳退火温度为52.2℃。用22份油葵材料对该体系进行验证,结果显示扩增条带清晰、多态性高,说明该体系稳定可靠,可有效的用于油葵种质资源的鉴定、遗传图谱构建等研究。     

葡萄5BB品种SRAP-PCR反应体系影响因素

为建立适合葡萄5BB品种的SRAP-PCR反应体系,利用正交设计对葡萄SRAP-PCR反应体系5种因素(Taq DNA聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)4个水平进行优化。结果表明,各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小顺序为:Mg2+,引物,dNTP,Taq DNA聚合酶,模板DNA;筛选出各因素的最佳水平,建立了葡萄5BB品种SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶2U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA60ng,dNTP0.25mmol/L,引物0.10μmol/L。这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对葡萄进行相关研究提供了帮助。     

淮山RAPD-PCR反应体系的建立

摘要：采用改良CTAB法提取淮山的叶片总DNA。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD-PCR扩增结果的影响,建立了适合于淮山RAPD-PCR反应体系,即20μL体系中包括：模板DNA为50 ng、Taq酶为0.2U、Mg2+浓度为3.0mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L。     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究(英文)

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。     

荔枝SCoT-PCR反应体系的建立及其在遗传分析中的应用

建立适于荔枝的SCoT反应体系,并利用SCoT体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行真假杂种鉴定和遗传多样性分析。采用正交设计方法对影响荔枝SCoT-PCR反应的rTaq酶、Mg2+浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物等因素进行体系优化。优化的荔枝SCoT反应体系为：20μL反应体系中含有模板DNA 30 ng,rTaq酶1 U,引物0.75μmol/L,Mg2+ 3 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L。最适退火温度为50.6℃。利用该体系对‘紫娘喜’、‘无核荔’及其杂交后代进行遗传分析,结果显示,32条引物共扩增出280个位点,多态性位点有131个,占总位点数46.78%。4条引物就可以将60株杂交后代鉴定出来。UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将30株杂交后代区分开,遗传相似系数在0.406~0.867,在相似系数0.68时,30株杂交后代可聚为3类。优化建立的荔枝SCoT体系结果稳定,重复性好,为荔枝遗传育种提供了新的技术支持。     

芒草ISSR分子标记体系的确定及引物的筛选

为建立并优化适用于芒草的ISSR-PCR扩增反应体系,进一步研究野生芒草群体的遗传多样性水平。以吉林省采集的芒草(Miscanthus sinensis)为材料,采用单因子试验的方法研究模板DNA、TaqDNA聚合酶的用量及引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响。结果显示：在20 μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。此外,筛选到10 条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

葡萄柚基因组DNA提取方法的比较及ISSR-PCR体系的优化

对4种基因组DNA提取方法进行比较,得到一种效率较高的、且适用于葡萄柚ISSR-PCR的DNA提取方法。同时,采用正交设计对影响葡萄柚ISSR-PCR的因子进行优化。实验结果表明,改良的SDS法提取的基因组DNA最适宜进行葡萄柚的ISSR-PCR扩增。ISSR-PCR产物在2%琼脂糖凝胶上检测,发现PCR扩增的平均条带数为2.7条。葡萄柚的最优ISSR-PCR反应体系为：20 μL总体积中含有2×buffer(Mg2+),0.2 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L引物,0.3 U Taq DNA聚合酶,5 ng DNA模板。     

苹果MSAP技术体系的优化及其应用

为建立适合苹果的MSAP(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)反应体系,以‘嘎啦’为材料对MSAP技术中的关键因素进行优化筛选,并用于苹果叶片和愈伤组织的甲基化模式分析。经过不同因素水平摸索,结果表明：600 ng基因组DNA用EcoRⅠ,HapⅡ或MspⅠ各10 U,37℃保温12 h,即可酶切完全。最佳预扩增体系为：酶连产物1 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 3 μL。20 μL选择性扩增体系中,含有60倍稀释的模板DNA 2 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 2 μL。在该体系下选用2对引物对苹果叶片和愈伤组织进行甲基化模式分析,获得了清晰、重复性好的银染指纹图谱。平均每对引物可获得特异性条带12条,共获得特异性条带91条,表明该体系可用于苹果不同发育阶段DNA甲基化模式分析。     

甜菜TRAP-PCR反应体系的建立及引物开发策略

以糖用甜菜为材料,利用单因素实验探讨甜菜TRAP-PCR反应体系中dNTPs、引物、模板以及DNA聚合酶等4个因素的浓度变化对扩增结果的影响,最终建立糖用甜菜的最佳TRAP-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜TRAP-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg²⁺）、10 ng的模板DNA、0.75 U的Taqase、10 μmol/L固定引物及随机引物各0.8 μL以及0.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。并建立了一种快速开发甜菜TRAP-PCR引物的方法,利用优化后的程序对15份糖甜菜品种进行扩增。结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,部分引物多态性丰富,可用于糖用甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

文冠果ISSR反应体系的建立及优化

为了建立文冠果ISSR-PCR最佳反应体系,从而为文冠果遗传多样性研究提供理论依据,从定西巉口林场文冠果人工林内选取健康嫩叶为试验材料,通过单因子试验研究了影响ISSR-PCR反应各因素的浓度,分析因子包括模板DNA用量、退火温度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度及TaqDNA聚合酶用量等。通过研究,找出了各因子合适的条件,建立并优化了文冠果ISSR反应体系,即20μL总反应体系含模板DNA约30 ng,Mg²⁺2.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,Taq聚合酶1 U。试验结果表明,在此反应体系下可得到多样性好、条带清晰的图谱。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L₁₆(4⁵)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg²⁺、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化。结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-PCR的25 μL最佳反应体系为：30~60 ng DNA模板,1.2 μL正反向引物(5 μmol/L),0.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5 μL 10× Top Taq buffer（含Mg²⁺）。利用优化后的反应体系对蔷薇科苹果属的21种植物材料进行检测,实验结果表明扩增产物均在100~200 bp左右,可扩增出2~3个有效等位基因。通过优化反应体系中的各影响因素,建立了最佳的SSR-PCR反应体系,可为苹果属植物不同种群的遗传变异研究及亲缘关系的分子鉴定提供前期研究基础。     

紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化

摘 要：为探索紫色观赏辣椒基因组DNA的最佳提取条件和建立ISSR-PCR最优反应体系,对比了三种基因组DNA提取方法,并通过正交设计实验优化了ISSR-PCR反应体系。结果表明,采用高盐低pH法从两种观赏辣椒中提取的基因组DNA的A260/A280值分别为1.807和1.818,DNA电泳条带明亮整齐,无拖尾;ISSR-PCR最优反应体系(20 μL)为：1×PCR buffer,1.5 mmol/L Mg2+,0.6 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶,60 ng模板DNA,扩增所得分子图谱稳定性高、重复性好;唯有高盐低pH法提取的DNA经该ISSR-PCR体系扩增能体现出两个辣椒品种间分子图谱的差异。     

杨梅SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜杨梅基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系。以杨梅基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、模板DNA、dNTPs、Tap DNA聚合酶和引物5种因素4个水平对杨梅SRAP-PCR反应体系进行优化。各因素对杨梅SRAP-PCR反应的影响程度从大到小依次为：Mg2+,模板DNA,dNTP,引物和Taq DNA聚合酶;建立的杨梅SRAP-PCR最佳反应体系为25μL反应体系中含2.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模板、0.25 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和1.5 U Taq DNA聚合酶。这一体系的建立为今后利用SRAP-PCR技术开展杨梅分子遗传学研究打下了基础。     

草莓SRAP反应体系优化及引物筛选

为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg²⁺ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。     

胡椒SRAP反应体系的建立和优化

建立并优化胡椒SRAP分子标记体系,为海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析、物种和品种鉴定等打下技术基础。利用单因素随机试验对胡椒SRAP-PCR反应体系中各组分（Taq DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物和Mg2+）的浓度进行优化,同时筛选SRAP-PCR反应的循环数和最适退火温度。通过实验确定了SRAP-PCR反应体系为：反应总体系为20 μL,其中引物0.35 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTP 0.6 mmol/L,Mg2 + 1.5 mmol/L,模板DNA 25~200 ng,同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度;最佳SRAP-PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,35℃退火30 s,72℃延伸45 s,5个循环;然后94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。SRAP-PCR体系适为胡椒属植物遗传多样性分析奠定了基础,并成功地应用于海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析。     

谷蠹RAPD反应体系与程序的优化

以谷蠹为研究对象,采用L16（45）正交组合实验和单因素梯度实验对MgCl2、dNTP、随机引物、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等影响RAPD扩增的重要因素进行优化,以期建立最优的RAPD反应体系与程序。实验结果表明：各因素最适条件为：25μL PCR反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP0.4 mmol/L,随机引物960 pmol/L,Taq酶0.5 U,模板DNA 20ng;退火温度为37℃,循环次数为45次。在对谷蠹进行RAPD分析时,采用优化的反应条件,规范实验操作,使用同厂家同批次的试剂,实验结果就会具有很好的重复性和稳定性。     

牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

通过研究牡丹杂交新品系的遗传多样性,解决其在牡丹品种分类体系中位置的问题。利用正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物浓度、DNA聚合酶和不同模板DNA浓度5种因素4个水平来优化牡丹杂交品系SRAP-PCR反应体系,对引物进行筛选。建立牡丹杂交品系SRAP-PCR反应最佳体系(25 μL)为： 2.0 mmol/L Mg2+、1.5 U Taq酶、0.25 mmol/L dNTPs、2 ng/μL模板DNA、0.25 μmol/L引物;运用试验结果从100对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物30对。优化体系的建立及引物的筛选,可为利用SRAP标记技术研究牡丹杂交品系的遗传多样性及亲缘关系提供技术基础和理论依据。