人工miRNA沉默基因的研究

人工miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源miRNA的前体为基本骨架,将其茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为amiRNA/amiRNA*序列,使产生的amiRNA作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。以拟南芥中转录因子基因MYB28为例,介绍了amiRNA的设计基本原理和构建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中间部分分别设计了amiRNA,以拟南芥内源的miRNA 319a前体为骨架,以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列,在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中MYB28表达水平平均降低了86%。根据试验结果对人工miRNA沉默基因技术的特点及应用前景进行了讨论。     

人工miRNA技术及其在植物抗病育种中的应用

内源miRNAs被认为是真核生物调控基因表达的重要调节因子,人工miRNA(amiRNA)是一种基于天然miRNA的结构用以沉默内源基因的有效策略。利用人工miRNA替换植物内源miRNA前体中miRNA/miRNA*序列,使产生的人工miRNA与靶基因配对,并特异性地抑制靶基因的表达。从天然miRNA的合成过程和作用机制,人工miRNA的设计基本原理及构建方法,人工miRNA技术在植物抗病育种上的应用等方面进行综述。     

RNA干扰体内导入技术研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种发展迅速并具有广阔应用前景的基因控制技术,它能特异性地沉默内源或外源性靶基因,已成为基因治疗的有效手段。然而,利用RNA干扰技术进行体内基因沉默的主要障碍是如何实现siRNA和miRNA的体内安全高效输送导入。该文结合国内外进展和本课题组在RNA干扰方面的研究成果,对RNA干扰体内导入技术作一综述。     

RNA干扰药物用于疾病治疗的安全性问题

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指由双链RNA介导的序列特异的转录后基因沉默。RNAi技术因其特异性、高效性而备受青睐,在疾病治疗方面表现出广阔的应用前景。然而,近年来的研究发现,基于RNAi技术开发的药物存在安全性问题,主要包括引起免疫反应、产生脱靶效应、以及存在竞争微RNA通路等。这些问题的突破将使RNAi技术获得更加广泛的应用。     

amiRNAi-实现高效稳定的特异基因沉默新方法

RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)是实现基因沉默的有效工具。近年来,随着分子生物学与生物技术的快速发展,在RNAi基础上又发展出另一种特异性更高的基因沉默技术—amiRNAi (artificial microRNA interference)。amiRNAs是一类由内源miRNA前体生成的长21个核苷酸的人工小RNA分子,它能在不影响其他基因表达的情况下特异地介导单个或多个靶基因高效稳定沉默。与普通的RNAi相比,amiRNAi具有特异性高、稳定性强和沉默效应可预见等优点。因而amiRNAi可能成为基因功能分析的最有效工具之一,同时amiRNAi对于基因负调控研究和应用而言前景广阔。着重介绍了amiRNAi技术的原理、优势及其潜在的应用价值。     

非完全互补shRNA对RNA聚合酶II启动子调控的RNAi的影响

RNA干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默技术,可有效诱导序列特异性基因沉默．由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA可有效介导RNAi效应,为组织特异性基因沉默提供了一条新的途径．但是,由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA（shRNA）在序列上与靶基因非完全互补对RNAi效应的影响鲜有报道．本文初步探索RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的shRNA碱基发生突变或缺失对RNAi效应的影响．研究表明,靶向hTERT mRNA的碱基突变shRNA显著降低RNAi效应,而靶向GFP mRNA的碱基缺失shRNA对RNAi效应没有显著影响．本研究为非完全互补shRNA对RNAi效应的进一步深入研究提供了理论与实验依据．     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制。RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中,这种调控可以由siRNA、shRNA及miRNA等小分子RNA参与。在此主要对RNAi的研究进展如背景、分子调控机制、存在的问题和应用前景等进行了综述。     

RNAi技术研究进展及其在医学中的应用前景

将双链RNA导入细胞内会引起与其同源基因的沉默,这种现象称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。就RNAi技术的定义、发现过程、作用机制、产生机理等方面的研究进展作一综述,同时对RNAi技术在医学领域中的应用和存在问题进行了展望。     

小RNA与蛋白质的相互作用

小分子调控RNA,包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）和piRNA（piwiinteracting RNA）、hsRNA（heterochromatin associatedsmall RNA）等,是当前生命科学研究的前沿热点。越来越多的证据表明,这些小分子RNA存在于几乎所有较高等的真核生物细胞中,对生物体具有非常重要的调控功能。它们通过各种序列特异性的RNA基因沉默作用,包括RNA干扰（RNAi）、翻译抑制、异染色质形成等,调控诸如生长发育、应激反应、沉默转座子等各种各样的细胞进程。随着对这些小分子调控RNA的发现,一些RNascⅢ酶家族成员、Argonaute蛋白质家族成员及RNA结合蛋白质等先后被鉴定为小RNA的胞内蛋白质合作者,参与小RNA的加工成熟和在细胞内行使功能。本综述简介一些RNA沉默作用途径中重要组分的结构和功能的研究进展。     

基因枪在RNA干扰中的应用研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指双链RNA（double-strand RNA,dsRNA）特异性降解同源mRNA,从而引发基因转录后水平沉默的现象,是一种高效、高特异性抑制基因表达的途径。自1998年Fire等发现RNA干扰现象以来,其特异性降解目的基因的优势吸引了众多研究者的目光。本文在简要综述RNAi技术在基因功能研究、抗病毒治疗,肿瘤基因治疗等领域的应用后,重点归纳了基因枪技术在RNAi研究即siRNA导入细胞中的应用,并简单分析其优势与意义。     

RNA干涉的临床前实验研究进展

RNA干涉（RNA interference,RNAi）是一种非常保守的细胞现象,在基础研究和疾病治疗方面具有重大的应用前景。尤其引人注目的是,新的RNAi方法学与已建立的转基因策略相结合,有效地将组织特异性RNAi导入到患者体内,有望治疗人类疾病。本文综述了RNAi的机制与在其临床前的实验研究,简要介绍了RNAi的新用途,讨论了RNAi基因治疗存在的问题,展望了RNAi基因治疗的应用前景。     

Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi

Artificial microRNA (amiRNA) sequences embedded in natural microRNA (miRNA) backbones have proven to be useful tools for RNA interference (RNAi). amiRNAs have reduced off-target and toxic effects compared to other RNAi-based methods such as short-hairpin RNAs (shRNA). amiRNAs are often less effective for knockdown, however, compared to their shRNA counterparts. We screened a large empirically-designed amiRNA set in the synthetic inhibitory BIC/miR-155 RNA (SIBR) scaffold and show common structural and sequence-specific features associated with effective amiRNAs. We then introduced exogenous motifs into the basal stem region which increase amiRNA biogenesis and knockdown potency. We call this modified backbone the enhanced SIBR (eSIBR) scaffold. Using chained amiRNAs for multi-gene knockdown, we show that concatenation of miRNAs targeting different genes is itself sufficient for increased knockdown efficacy. Further, we show that eSIBR outperforms wild-type SIBR (wtSIBR) when amiRNAs are chained. Finally, we use a lentiviral expression system in cultured neurons, where we again find that eSIBR amiRNAs are more potent for multi-target knockdown of endogenous genes. eSIBR will be a valuable tool for RNAi approaches, especially for studies where knockdown of multiple targets is desired.     

Comparative Studies of Various Artificial microRNA Expression Vectors for RNAi in Mammalian Cells

Artificial microRNA (amiRNA) has recently become an important RNA interference (RNAi) technology for gene therapy and gene function studies. Here nine expression strategies were employed to construct plasmid vectors expressing amiRNA (amiR-Fluc) against firefly luciferase (Fluc). Our results indicate that all nine vectors can successfully produce mature amiR-Fluc and specifically suppress the expression of Fluc, although the RNAi efficiency in different mammalian cells displays obvious differences. Among these nine vectors, three can efficiently co-express DsRed reporter gene linked with amiR-Fluc cassette. Moreover, the recommended number of concatenated amiRNAs in a multi-amiRNA expression vector should not be more than four, and the relative position of an amiRNA in the multi-amiRNA expression vector has no apparent influence on its RNAi activity. In summary, all these results described here provide valuable information for the rational design and application of amiRNA expression vector.     

基于miRNA-155结构的人工miRNA表达载体的构建与评价

目的:建立一种适用于人工miRNA(amiRNA)表达研究的克隆载体。方法:基于实验室构建的短发夹RNA(shRNA)表达载体pshOK-basic,将鼠源miRNA-155的侧翼序列插入合适的酶切位点构建得到amiRNA重组表达载体pOK-basic;应用本载体分别构建靶向萤火虫荧光素酶(luc2)和红色荧光蛋白(mCherry)基因的amiRNA并检测其沉默效果。结果:应用此载体能快速高效地构建amiRNA,靶向luc2和mCherry报告基因的amiRNA能较好地抑制靶基因的表达。结论:构建了一种能高效表达amiRNA的克隆载体,为amiRNA的进一步研究及应用奠定了基础。     

应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒

目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。     

miRNA与siRNA胃癌相关研究的现状及进展

RNA干扰是表观遗传学的研究热点,它参与基因复制后表达调控,并与肿瘤发生密切相关。近年对RNA干扰研究较多的是微小RNA和小干扰RNA。文章概述了微小RNA和小干扰RNA的基本理论,并综述它们在胃癌研究中的现状及进展。认为RNA干扰分析和应用是研究胃癌相关基因功能及作用机制的有效方法,并将对胃癌的诊治产生巨大影响。     

RNAi技术在蜂学研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性引起基因表达沉默的现象,特异性和高效性是RNAi技术的特点。本文主要从调控目标基因的表达、级型分化的分子基础、防治蜜蜂病毒病3个方面概述了RNAi技术在蜂学研究中的应用进展情况,并展望RNAi技术在蜜蜂功能基因组研究领域的应用前景。     

The MIXTA-like Transcription factor MYB16 is a major regulator of cuticle formation in vegetative organs

Cuticle secreted on the surface of the epidermis of aerial organs protects plants from the external environment. We recently found that Arabidopsis MIXTA-like R2R3-MYB family members MYB16 and MYB106 regulate cuticle formation in reproductive organs and trichomes. However, the artificial miRNA (amiRNA)-mediated knockdown plants showed no clear phenotypic abnormality in vegetative tissues. In this study, we used RNA interference (RNAi) targeting MYB16 to produce plants with reduced expression of both MYB16 and MYB106. The rosette leaves of RNAi plants showed more severe permeable cuticle phenotypes than the myb106 mutants expressing the MYB16 amiRNA in the previous study. The RNAi plants also showed reduced expression of cuticle biosynthesis genes LACERATA and ECERIFERUM1. By contrast, expression of a gain-of-function MYB16 construct induced over-accumulation of waxy substances on leaves. These results suggest that MYB16 functions as a major regulator of cuticle formation in vegetative organs, in addition to its effect in reproductive organs and trichomes.