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相似文献
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1.
在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白   总被引:2,自引:0,他引:2  
 【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性,即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段,本文构建了解离载体pBMB5401,并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401,分别得到重组质粒pBMBcaiiA,pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922,重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组,消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR,BMB3aiiAR和BMB3439R,在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达,具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力,当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。  相似文献   

2.
将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.  相似文献   

3.
选择对赤霉病菌具有高度特异性和亲合力的单链抗体,与植物防御素构建成融合蛋白基因,将融合蛋白及防御素基因分别与细菌表达载体pGEX和植物表达载体pMBL4构建成重组载体,在细菌中经IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化蛋白;经根癌农杆菌介导的真空渗入法在烟草叶片中瞬间表达,提取叶片总蛋白用于鉴定。抑菌活性分析表明,烟草叶片瞬间表达的防御素和抗体-防御素融合蛋白,均对赤霉病菌有强烈的抑菌作用;从细菌中纯化的防御素蛋白,也能有效抑制赤霉病菌生长。说明赤霉病菌抗体-防御素融合蛋白基因,可作为抗赤霉病资源,用于改良植物的抗赤霉病性。  相似文献   

4.
利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活.  相似文献   

5.
采用PCR技术扩增TAT-H1bs融合基因,并通过基因操作构建了融合基因的原核重组载体pET-28a-TAT-Hlbs。将阳性重组质粒转化至受体菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western-blot检测。结果表明:重组菌能够表达目的蛋白,软件分析结果表明表达蛋白约占菌体蛋白的40%,上清表达量约为20%。上清蛋白经纯化后,Western-blot结果显示,His-Tag单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。所获得的融合蛋白以高效胞质可溶形式表达。  相似文献   

6.
对铜绿假单胞菌脂肪酶基因(Lip A)进行克隆,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并在枯草芽孢杆菌pab02中整合表达。根据铜绿假单胞菌Lip A基因设计引物,扩增Lip A基因,并进行测序,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,转化枯草芽孢杆菌pab02,并对转化后的阳性菌株进行诱导表达。结果显示,成功从铜绿假单胞菌A05菌株中扩增到长1 092 bp的Lip A基因,该基因与铜绿假单胞菌Lip A基因(登录号为AB290342)的同源性高达98%;该基因共编码311个氨基酸(aa),包含26个aa组成的信号肽和285个aa组成的成熟肽;成功构建了整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并将Lip A整合到枯草芽孢杆菌pab02染色体上,获得了重组枯草芽孢杆菌pab02–lip A;SDS–PAGE分析结果表明,脂肪酶蛋白得到了有效表达,该蛋白的相对分子质量约为37 000。  相似文献   

7.
家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能   总被引:1,自引:1,他引:0  
【目的】 分析家蚕(Bombyx mori)整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】 利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】 家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca 2+的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结果】 整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。  相似文献   

8.
为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有很好的特异性;小鼠免疫保护试验结果表明,ETA对铜绿假单胞菌感染的保护率达50%,显著高于对照组的免疫保护率。用DNAman软件对ETA序列同源性进行分析,发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌,铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性;用MEGA软件对ETA的进化分析结果表明,不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌,据此可推测ETA免疫动物产生的特异性抗体可能为不同种类铜绿假单胞菌的感染提供交叉免疫保护。  相似文献   

9.
从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)野生型菌株YBT-9602基因组中通过PCR扩增到编码一种具有细胞壁锚定活性的芽胞皮层水解酶的编码基因mbA。序列测定和编码产物结构域预测分析显示,mbA编码产物在结构上由1个具有肽聚糖结合性能的N-末端结构域和1个具细胞壁水解酶活性的C-末端结构域组成,具有作为细胞表面展示系统的运载蛋白的潜力。通过体外构建mbA与绿色荧光蛋白基因gfp的融合基因(mbA-gfp)并导入苏云金芽胞杆菌受体菌中进行表达,经对重组菌全细胞免疫荧光显微镜观测、蛋白酶pronase消化试验和SDS处理,证实GFP被成功展示于受体菌细胞表面;经流式细胞仪测定,以细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶为靶蛋白的表面展示系统有42.97%的重组菌细胞可展示融合酶,重组菌具有13.5U/mL的全细胞酶活性。结果表明,MbA作为一种细胞壁锚定蛋白可用于构建新的苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统。  相似文献   

10.
AMEP是来自于枯草芽孢杆菌的一种新型蛋白激发子,可诱导植物叶片发生过敏反应并激发植物的防卫反应,提高植物的抗病性,是生物农药的理想候选。为了研究AMEP蛋白的聚合体状态与金属离子之间的关系,以及蛋白多聚体对其活性的影响,比较了不同浓度Fe2+对AMEP蛋白激发子的聚合程度和活性的影响,设置0.03、0.3、3 g·L-1Fe2+3种浓度梯度的Fe2+与AMEP蛋白混合溶液处理烟草叶片,并通过过敏反应、酶活、灰霉抗病试验对烟草叶片的生理指标进行检测。低浓度Fe2+能够增加AMEP聚合程度提高蛋白活性,从而增强烟草的过敏反应和早期防御反应和某些防御酶的激发,从而增加对灰霉病的抗性;而高浓度Fe2+则会降低蛋白活性。综上,低浓度的Fe2+与AMEP蛋白结合形成了更多适宜其发挥蛋白性能的多聚体,能更好地保存酶解位点以便其发挥其性能,从而提高AMEP蛋白的活性。  相似文献   

11.
黄河三角洲湿地不同植物群落土壤盐分分布特征   总被引:1,自引:0,他引:1  
为研究黄河三角洲地区不同植物群落下土壤盐分含量的空间变化特征,以及盐分指标之间的关系,于2012年10月利用经典统计分析、变异分析等方法,开展了植物样地调查和土壤剖面采样分析。结果表明:研究区属于重盐土类型(含盐量>4.0 g·kg-1)。水平方向沿柽柳群落-碱蓬群落-芦苇群落-棉花群落演替,土壤盐分含量呈逐渐降低之势。垂直方向上:柽柳群落和碱蓬群落土壤盐分随土壤深度的增加而减小,土壤盐分表现出明显的表层富集特征;芦苇群落和棉花群落土壤盐分表现为随土壤深度增加先增大后减小的趋势。盐分在不同植物群落类型中大多属于中等强度变异性,但是,柽柳群落中的SO42-、芦苇群落中的Mg2+和Cl-在水平方向上表现出强烈的变异性,碱蓬群落中的CO32-在水平和垂直方向均表现出强烈的变异性,棉花群落中的CO32-在垂直方向上表现出强烈的变异性。在0~80 cm的土壤剖面土体中,K+、Na+、Ca2+、Cl-和HCO3-在前述4种植物群落中差异显著(P<0.05),而Mg2+、SO42-、CO32-则无明显差异。土壤中Cl-含量与土壤全盐含量呈极显著相关(P<0.01)。因此,控制或减少Cl-投入可能是一条减轻黄河三角洲地区土壤盐渍化程度的合适途径。  相似文献   

12.
为深入了解同时发生盐渍化和酸化对设施栽培土壤镉活性的影响,采用模拟试验方法研究不同pH、盐分种类和盐分积累程度下土壤中水溶性镉及蔬菜对镉吸收的变化。结果表明,土壤中水溶性镉含量和蔬菜地上部分镉积累量均随土壤酸化与盐渍化程度的提高而增加。当土壤pH值为5.00~5.50时,土壤水溶性镉含量随盐渍化增加的变化最为明显。当土壤镉含量为0.55 mg·kg-1、盐分积累量为2.50 g·kg-1时,在土壤pH值分别为6.15、5.50和5.00的条件下,土壤水溶性镉含量分别较对照(未盐化)增加10.53%、44.00%和51.06%,蔬菜镉含量分别较对照(未盐化)增加20.00%、16.85%和36.36%,当土壤pH值由6.15降低至4.00后,土壤水溶性镉和蔬菜地上部分镉含量分别提高了近4倍和8倍。土壤镉活化因盐分离子种类不同而异:阳离子的影响程度为Ca2+、Mg2+>K+>NH4+,阴离子的影响程度为Cl->SO42->NO3-。土壤中水溶性镉和蔬菜对镉的吸收同时随酸化和盐渍化增强而增加的结果表明,土壤盐渍化和酸化对镉的活化具有叠加作用。  相似文献   

13.
为分析山丘河谷平原地带农业集约化发展条件下地下潜水氮素情况,对浙江长乐江流域河谷平原地带地下潜水以月为单位连续采样分析,研究该地区地下潜水中氮素浓度的季节性动态变化和空间分布情况,并以各个采样点为圆心,分别提取每个样点周围8种半径(50、100、250、500、750、1 0000、1 250、 1 500 m)的圆形区域中各类土地利用类型面积,分析不同土地利用类型面积占比与地下潜水中氮素浓度的关系。结果表明,地下潜水中硝态氮(NO3--N)浓度总体平均值为(1.326±0.618) mg·L-1,总氮(TN)浓度总体平均值为(2.717±1.614) mg·L-1,地下潜水中TN与NO3--N浓度的时空变化呈现出高度的一致性,时间分布上两者浓度均在丰水期大于枯水期,空间分布上则从以园地(蔬菜、苗木)和耕地(水稻、油菜)为主要土地利用类型的区域向周边递减。各土地利用类型中,以园地对NO3--N和TN浓度值贡献最大。地下潜水中的氨氮(NH3-N)浓度总体平均值为(0.434±0.158)mg·L-1,占TN的16%。各监测点丰水期的NH3-N浓度普遍低于枯水期,并呈现靠近水域的监测点氨氮浓度偏高的趋势。  相似文献   

14.
采用三因素五水平二次回归正交旋转组合设计的方法,研究不同密度(x1)、氮肥(x2)及硼肥(x3)对凤紫运1号紫色辣椒产量的影响,结果表明,三个因素线性项对辣椒产量影响为正向极显著,效应大小顺序是x2>x3>x1,二次项影响为负向极显著,顺序是x12>x32>x22,x1x3互作效应正向极显著,x1的边际效应最大。当定植密度4 123株·667m-2,氮肥40.020 kg·667m-2,硼肥1.000 kg·667m-2时产量最高,为3 206.678 kg·667m-2。综合因子频数分析表明,95%置信度下凤紫运1号产量高于2 500 kg·667m-2的高产栽培的因子优化组合为:密度3 903~4 172株·667m-2,氮肥施量31.186~36.081 kg·667m-2,硼肥施量0.724~0.880 kg·667m-2。  相似文献   

15.
对不同形态氮素的吸收利用过程及其对植株生长、抗逆性、品质和安全性的影响,以及外界环境条件对其作用效果的影响进行了综述,发现硝态氮(NO3--N)可促进植株根系伸长及植株对阳离子的吸收;铵态氮(NH4+-N)可缓解盐胁迫及活性氧对植株的伤害,还能提高植株对病害的抵抗能力,但单一施NH+4-N易造成NH+4毒害,如细胞酸度增加、活性氧伤害、细胞壁木质化等。此外,对今后的研究方向进行了展望,以期为农业氮肥的合理施用提供理论依据。  相似文献   

16.
初始pH值对畜禽粪便和菌渣混合高温堆肥的影响   总被引:3,自引:0,他引:3  
以猪粪和菌渣为主要原料,过磷酸钙和石灰作为pH调节剂,设计8个不同pH值的堆肥处理,研究堆肥初始pH值与堆肥腐熟进程及理化性状的关系。结果表明,在本试验条件下,随着堆肥初始pH值的提高,堆肥升温速率、最高温度和有机物降解率均上升。然而,pH值的提高导致堆肥中NH4+-N的积累量下降,堆肥产品中氮素损失上升。综合考虑堆肥效率和产品质量等因素,建议畜禽粪便堆肥中添加石灰量不要超过堆料鲜质量的0.6%或添加过磷酸钙量不要超过堆料鲜质量的5.2%。堆肥初始pH值在6.42~6.83之间有利于减少氮素损失和提高堆肥效率。  相似文献   

17.
为研究不同灌水器间距对湿润体特性及水氮运移规律的影响,优化涌泉根灌灌水器相关技术要素,在西北农林科技大学远志山试验站进行了双点源交汇入渗试验。试验设置3个灌水器间距水平(40、50、60 cm),肥液质量浓度为10 g·L-1,涌泉根灌灌水器流量为5 L·h-1,探究不同灌水器间距对涌泉根灌肥液交汇入渗特性及湿润锋运移规律、土壤水分、铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)分布特性的影响。结果表明,涌泉根灌不同条件下,自由入渗和交汇入渗累积入渗量、增渗量以及不同方向湿润锋运移距离均与灌水器间距呈正比例幂函数关系(R2>0.9,P<0.01);灌水器间距越大,交汇面向上、向下湿润锋运移距离越小(P<0.05);交汇入渗侧土壤含水率降低幅度小于自由入渗侧,灌水器间距越大,交汇面湿润程度越低(P<0.05);自由入渗条件下,距灌水器出水口距离越大,NH4+-N含量降低越显著(P<0.05),而交汇入渗侧NH4+-N含量降低幅度小于自由入渗侧;NO3--N含量在不同时刻、不同位置有较大差异,灌水结束后,湿润区表层土壤NO3--N含量略有降低,水分分布时间越长,不同土层深度处的NO3--N含量越高(P<0.05)。建立了涌泉根灌交汇入渗累积入渗量、湿润锋运移距离随时间和灌水器间距变化的数学模型,其中模型参数K、a与灌水器间距呈幂函数关系变化,K值随间距的增加而减小,a值随间距的增加而增大;建立了土壤含水率、土壤NH4+-N及NO3--N含量与灌水器距离之间的关系模型,并对入渗土体任一点至灌水器中心距离r处土壤含水率、NH4+-N及NO3--N含量进行了定量估算,估算结果偏差在±10%以内。研究结果为涌泉根灌节水灌溉技术的进一步完善奠定了科学基础。  相似文献   

18.
为了从离子响应的视角探究氯通道抑制剂缓解栽培大豆幼苗盐伤害的作用机理,以大豆栽培品种绥农35为试验材料,采用大豆幼苗期盐胁迫外加氯通道抑制剂的方法,比较不同处理幼苗的相关生理指标、解剖结构和离子组的差异。结果显示:外加不同氯离子抑制剂对盐胁迫作用效果不同,分别表现为ZnCl2能缓解栽培大豆幼苗的盐伤害作用,但尼氟灭酸(NFA)和蒽-9-羧酸(9-AC)则相反,加重了盐害作用;外加Zn2+,根部次生导管孔径回升,皮层细胞厚度减少,有利于降低根部总消耗,缩短水分和矿质离子横向运输的距离;外加Zn2+,叶部叶绿素含量、叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)值,N O 3 -以及微量元素(Fe, Mn, Cu和Zn)含量均回升,而Cl-含量回落介于对照组与盐处理组之间。综上表明,盐胁迫下外加Zn2+可重建幼苗叶部的离子稳态,降低叶部Cl-毒害,提高幼苗抗氧化能力和光合能力,有效缓解大豆幼苗受到的伤害。  相似文献   

19.
为探究环境因子对智利竹筴鱼资源丰度的影响,根据2012—2018年4—8月中国东南太平洋智利竹筴鱼(Trachurus murphyi)渔捞日志数据,基于不同环境因子(海面温度、叶绿素a浓度、海面温度异常值和海面高度异常值)组合建立5个环境剩余产量(EDSP)模型。结果表明:海面温度对智利竹筴鱼单位捕捞努力量渔获量影响最大,其次为海面温度异常值和叶绿素a浓度,海面高度异常影响相对较小;基于海面温度、叶绿素a浓度、海面温度异常值和海面高度异常值的剩余产量模型拟合程度最好,表达式为Cn=1.749?12En-0.000?13En2+0.003?50TnEn-1.978?76AnEn-2.755?30HnEn+0.246?74SnEn;捕捞努力量、海洋环境因子海面温度、叶绿素a浓度、海面温度异常值和海面高度异常值均不同程度地影响智利竹筴鱼资源丰度的变动。  相似文献   

20.
为探究吲哚乙酸添加的先后顺序和质量浓度对周丛生物去除水体中氮磷的影响及其作用机理,以人工培养的周丛生物为研究对象,分别用预先经过吲哚乙酸培养的周丛生物(预处理组)和未经过吲哚乙酸培养的周丛生物(对照组)在含有不同质量浓度(0、5和10 mg·L-1)吲哚乙酸的氮磷污水中培养.结果 表明,添加吲哚乙酸提高了周丛生物对水体...  相似文献   

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