rDNA-RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种间鉴定初探

目的 探讨rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术构建毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析,尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定。方法 收集8种14株毛孢子菌,对其进行rDNA-ITS/IGS1扩增测序,并分别应用HaeⅢ、HhaⅠ、HaeⅢ和HhaⅠ双酶、HinfⅠ、MspⅠ和TaqⅠ对扩增片段进行RFLP酶切。结果 rDNA-ITS-RFLP多酶切可将8种毛孢子菌分为不同进化分支的4个亚类,而rDNA-IGS1-RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定,并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分。结论 rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术有望用于毛孢子菌属种水平的快速鉴定。     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

临床常见毛孢子菌的鉴定

为了探讨临床常见毛孢子菌（Trichosporon spp.)的鉴定方法，在形态学、营养生理学试验的基础上对临床常见的毛孢子菌－皮瘤毛孢子菌（Trichosporon inkin)、皮毛孢子菌（Trichosporon cutaneum)及阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii)进行核糖体核糖核酸（rRNA)基因（rDNA)的内转录间区（ITS）扩增，用限制性内切酶Cfr3I、NcoI对聚合酶链反应（PCR）产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析及序列测定，发现用Cfr13I做酶切，皮毛孢子菌的RFLP带型和阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不同；用NcoI做酶切，皮瘤毛孢子菌的带型与另两者不一致，序列分析的结果与形态学、营养生理学试验一致。结果提示，温度试验、API 20C、RFLP及序列测定可用于鉴定临床常见的毛孢子菌。     

基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型

目的:建立和评价基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术。方法:采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增omp1基因的VS1-VS2序列,以限制性酶切片段多态性分析(RFLP)进行检测分型,与VS1-VS2测序分型结果比较。结果:扩增12株沙眼衣原体标准株omp1基因VS1-VS2序列,长度为453-463 bp,用AluⅠ及DdeⅠ酶切此得出标准血清型的特征性图谱。37例沙眼衣原体ELISA检测阳性标本的VS1-VS2-PCR扩增均阳性,RFLP检到B-K型和2例混合型感染,分型率为94.59%。与DNA直接基因测序分型进行对比,符合率为94.59%。结论:基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术,较以前的方法更为敏感和特异,可作为对沙眼衣原体分型研究的工具。     

拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR-RFLP法鉴别常见皮肤癣菌

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ基因区PCR～RFLP法鉴别常见皮肤癣菌的可行性。方法：用真菌拓扑异构酶Ⅱ基因区通用引物dPsD1、dPsD2，先后对6种34株临床常见皮肤癣菌和2株白念珠菌以及4株曲霉的DNA进行巢式PCR（nested PER）扩增，扩增后的阳性产物分别用限制性内切酶HincⅡ和HinfⅠ酶切，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，根据结果来鉴定皮肤癣菌并在种的水平上区分这6种常见皮肤癣菌。结果：通用引物dPsD1对6种皮肤癣菌均能扩增出3390bp、dPsD2能扩增出2380bp的片段，而白念珠菌和曲霉则未见阳性扩增条带。扩增出的产物分别经HincⅡ和HinfⅠ酶切后表现为58—1670bp长短不等的片段组合，根据这些特异性条带谱可以区分这6种临床常见皮肤癣菌。结论：拓扑异构酶Ⅱ基因区的巢式PCR—RFLP方法，是鉴定和区分常见皮肤癣菌的有效方法。     

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。     

脉冲场凝胶电泳及随机扩增多态性DNA对淋球菌的基因分型

目的　评价脉冲场凝胶电泳限制性内切酶分析 (PFGE REA)及随机扩增多态性DNA (RAPD )分析对淋球菌分离株进行基因分型的能力。方法　 3 6株淋球菌分离株基因组DNA以SpeⅠ酶切及脉冲场凝胶电泳。并以随机引物OPA 0 3对 3 6株菌进行RAPD分析。结果　PFGE REA在 3 6株菌中产生 1 2～ 1 9个DNA片段 ( 5～ 6 0 0kb) ,区分出 2 0种PFGE型。以OPA 0 3扩增淋球菌DNA ,获得 1 5个不同的DNA片段( 2 80～ 1 90 0bp)。每株菌有 3～ 9个片段。 3 6株菌呈现 1 8种RAPD型。研究表明 ,PFGE REA与RAPD可区分属相同营养型及抗生素谱的菌株 ,二种方法分型结果总的趋向一致。不同地区的分离株甚至同一地区的某些分离株存在相当大的DNA多态性。具相同或十分相似基因型的菌株为某一特定地区所特有。认为PFGE REA及RAPD是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的分子技术 ,有助于了解菌株来源、菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性的传播。与PFGE REA相比 ,RAPD分析相对快速、简便和经济     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

马拉色菌临床株分类鉴定的研究

目的用PCR-RFLP方法对马拉色菌临床株快速分类，并结合生化鉴定分析结果的可靠性。方法先用吐温试验和过氧化氢酶试验对74株分离自花斑癣的马拉色菌临床株和7株标准菌株进行分种，再用特异性引物扩增马拉色菌的28S rDNA，对扩增产物分别用Eco88Ⅰ、Bsp143Ⅱ和BshNⅠ进行RFLP分析，结果3种限制性内切酶成功地将限制、钝形和厚皮马拉色菌鉴定出来．并发现限制马拉色菌在基因同源性上与其他6种马拉色菌存在较大差异。此外通过RFLP法还纠正了生化分型的错误。结论PCR-RFLP法是一种有希望能够快速、准确对马拉色菌属进行种间分类的分子生物学技术。     

致病性外瓶霉的PCR-RFLP分类

应用PCR方法对致病性外瓶霉进行分类鉴定。以ITS3和ITS4为引物 ,对常见的7种致病性外瓶霉的模式株核糖体DNA转录间隔区(ITSⅡ)进行扩增 ,4种内切酶(HinFI、MspI、BsuRI和RsaI)酶切。各种间多态性显著 ,常规方法难以鉴别的皮炎外瓶霉和甄氏外瓶霉较易区分。PCR RFLP准确可靠 ,可用于形态及其他方法难以确定的致病菌种的鉴别。     

新疆头癣紫色毛癣菌分离株的PCR-RFLP基因分型

目的 探讨新疆地区紫色毛癣菌的基因特点,为新疆儿童头癣致病菌的分子流行病学研究提供依据。 方法 用5种限制性内切酶HaeIII,Bgl I,MspI,DdeI 及MboI,采用PCR限制性片段长度多态性（RFLP）法对分离于新疆儿童头癣的30株紫色毛癣菌的rDNA非转录间隔（NTS）区进行基因分型,并与北京的9株、台湾的2株紫色毛癣菌做比较。结果 内切酶DdeI将全部41株菌分为12个基因型。新疆的30株菌分为10个基因型,其中17株菌分为D、F、G、H、I、J、K 7个基因型,与北京和台湾菌株间有明显基因差异,其余13株菌分3个基因型,与北京和台湾菌株有基因同源性。结论 新疆地区儿童头癣分离的紫色毛癣菌既有独特基因型,又与北京、台湾菌株有基因同源性,体现了新疆紫色毛癣菌的基因多态性。     

Rapid identification of Trichophyton tonsurans by PCR-RFLP analysis of ribosomal DNA regions

BACKGROUND: Culture morphology of Trichophyton (T.) tonsurans, an emerging pathogen of dermatophytosis in Japan, varies widely and species level identification is sometimes very difficult. Reliable molecular markers are expected to be introduced for their identification. OBJECTIVE: The present study was conducted to evaluate the efficacy of restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of PCR amplified ribosomal (r) DNA including internal transcribed spacers (ITS), as an identification tool. METHODS: Total cellular DNA was extracted from 26 Japanese isolates of T. tonsurans, along with several taxa of the members in the T. mentagrophytes complex, T. rubrum, T. violaceum and Epidermophyton floccosum, using a mini-preparation method. PCR amplicons were digested with restriction enzymes Mva I or Hinf I, then electrophoresed on 5% polyacrylamide gel. RESULTS: The banding profiles were observed about 8 h from initiating DNA extraction. Intraspecies polymorphism was not detected among T. tonsurans isolates, and their profiles obtained using Mva I digestion were clearly different from those of the other dermatophyte species. The restriction profiles evaluated from nucleotide sequence of the regions by a computer analysis were compatible with the electrophoresed profiles on gel. CONCLUSION: PCR-RFLP analysis is a rapid and reliable tool for the identification of T. tonsurans.     

菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究

目的 探讨菌落PCR在检测病原性丝状真菌方面的应用价值。方法 初步建立用于丝状真菌的菌落PCR检测技术,用19种丝状真菌标准株进行验证,所有菌落PCR扩增产物进行测序,并选取8种菌株的菌落PCR产物和酶切结果与常规PCR进行比较,检测其准确性和可靠性。结果 19株菌中有16株（84.2%）菌落PCR成功扩增内转录间隔（ITS）区,ITS区基因序列分析鉴定菌种正确,与NCBI数据库中相同菌种的相似度为96% ~ 100%;与常规PCR进行比较的8株菌中,除构巢曲霉菌落PCR扩增结果为阴性外,其他菌种菌落PCR产物及酶切条带与常规PCR基本一致。结论 与常规PCR相比,菌落PCR检测丝状真菌操作简单,省时省力,鉴定菌种具有较高的准确性和可靠性,可以用于丝状真菌的快速鉴定。     

中国致病格特隐球菌的基因亚型分析

目的 探讨中国致病格特隐球菌的基因亚型与世界范围内格特隐球菌的分子流行病学关系。方法 扩增受试格特隐球菌IGS1、PLB1和GEF1位点的部分可变区,检索GenBank上相应位点的序列信息,进行多位点的序列比对和系统发育分析。结果 ①我国VGⅠ基因型和α交配型菌株在3个位点的序列与以菌株WM276为代表的一种基因亚型相同,国内首株VGⅡ基因型和α交配型菌株的序列与温哥华岛致病株R272一致。②针对GEF1基因部分片段的聚类分析准确鉴定受试格特隐球菌的基因型和交配型。结论 中国致病格特隐球菌VGⅠ基因型与世界上分布较广的一种基因亚型相似,首株VGⅡ基因型菌株与温哥华岛致病性弱的VGⅡb基因亚型相似。     

Molecular epidemiology of Arthroderma benhamiae, an emerging pathogen of dermatophytoses in Japan, by polymorphisms of the non-transcribed spacer region of the ribosomal DNA.

In Japan, several isolates of Arthroderma benhamiae, a teleomorphic member of Trichophyton mentagrophytes complex, which were not found by earlier mating studies, have recently been recovered from human and animal dermatophytoses. In the present study, intraspecies polymorphism of A. benhamiae isolated in Japan was investigated using restriction fragment length polymorphisms (RFLP) of the non-transcribed spacer (NTS) region of the ribosomal DNA (rDNA), a method introduced to detect intraspecies polymorphisms of other dermatophyte species, such as T. rubrum. Based on their restriction profiles, there were five DNA types out of eight strains of A. benhamiae isolated in Japan. None of the five DNA types were found among the registered tester strains of A. benhamiae. Therefore, several different strains of A. benhamiae may have been brought into Japan separately.     

系统性红斑狼疮患者DNaseⅠ基因突变与血清DNaseⅠ活性的关系

目的 探讨SLE患者血清中脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)活性下降与DNaseⅠ基因突变的内在联系。方法 选择SLE患者70例,用DNA-甲基绿比色法测定血清DNaseⅠ的活性,并以正常人作平行对照;收集SLE患者100例,应用限制性片段长度多态性检测患者体细胞DNaseⅠ基因组第172位A→T的基因突变。突变后的基因产生一个NSPⅠ酶切位点,在适当条件下进行酶切可鉴别出发生突变的基因。结果 该组病例中未发现体细胞DNaseⅠ基因组第172位A→T的突变。结论 我国SLE人群中暂未发现该突变位点,SLE患者DNaseⅠ活性降低可能与该基因突变无关。     

PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较

目的 探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法 以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果 多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％ ～ 97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％ ～ 100％之间。分子发育树中，VNⅠ－VNⅣ基因型、VGⅠ－VGⅣ基因型分别聚在一类。结论 针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。