小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定

目的：克隆小鼠次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC)基因，并构建真核表达载体。在体内外检测该表达载体表达产物的免疫趋化功能。方法：用RT—PCR从C57BL／6小鼠胸腺组织中克隆小鼠SLC基因，构建真核表达载体pcDNA3．1—msLC。在体外，用基因枪转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞；RT—PCR检测转染细胞有SLC的表达；利用趋化小室法，检测表达产物针对淋巴细胞的趋化活性。在体内，用基因枪通过小鼠皮肤局部转染SLC基因，观察转染局部淋巴细胞的浸润。结果：克隆的基因经测序证实，为小鼠SLC基因Scya21b型。转染SLC基因的B16F10细胞体外培养48h后，RT—PCR检测到SLC的表达，同时培养基上清具有针对淋巴细胞的趋化活性。通过基因枪局部转染小鼠皮肤，24h后皮肤病理检查显示，局部皮内有明显的淋巴细胞浸润。结论：从小鼠胸腺组织中克隆到小鼠SLC基因，构建的真核表达载体pcDNA3．1—mSLC在体内外均可以表达，并具有针对淋巴细胞的趋化活性。     

SLC基因修饰树突状细胞及不同免疫方式抗肿瘤作用探讨

目的：应用次级淋巴组织趋化因子（SLC）成熟肽基因／重组腺相关病毒（rAAV—SLC）转染树突状细胞（DC），探讨一种基因修饰DC的新方法及其抗肿瘤的生物学活性。方法：体外构建rAAV-SLC，按MOI为10、50、100与腺病毒（Ad2）协同转染小鼠骨髓来源成熟和未成熟DC，GFP作为成功转染的示踪蛋白。RT—PCR在mRNA水平、ELISA在蛋白水平检测SLC表达，Transwell检测转染DC的培养上清对T细胞的趋化作用。瘤苗的在体效应通过C57BL／6J小鼠肿瘤模型验证。皮下接种Hepal-6肿瘤细胞后成瘤小鼠分成3组：①生理盐水对照组，瘤内或足垫注射NS；②单纯DC对照组，瘤内或足垫注射未修饰DC；③SLC基因修饰DC组，瘤内或足垫注射SLC基因修饰的DC。每隔7天注射1次，观察各组小鼠肿瘤的生长情况。4周后分离瘤体，用荧光免疫组化检测瘤体内CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞浸润情况。结果：rAAV—SLC在MOI为100时能成功转染DC，未成熟DC的转染效率显著高于成熟DC，并产生对T细胞有明显趋化生物学活性的SLC。动物实验表明，瘤内注射SLC修饰后DC，肿瘤大小与对照组有明显差异，免疫组化显示瘤体内有较多的CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞浸润。足垫注射SLC修饰的DC与对照组相比，抗肿瘤作用无显著差异。结论：rAAV—SLC在Ad2的辅助下能有效转染未成熟DC并能表达具有趋化生物学活性的SLC。SLC基因修饰的树突状细胞瘤内注射以其对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的吸引作用而发挥了明显的抗肿瘤作用，同时也进一步证实用树突状细胞进行肿瘤生物免疫治疗时，不同免疫方式对疗效有明显影响。     

hMIP-1β基因转染小鼠结肠腺癌CT26细胞对免疫细胞的体内外趋化作用

探讨转染人巨噬细胞炎性蛋白1β(human macrophage inflammatory protein-1 beta,hMIP-1β)基因的小鼠结肠腺癌CT26细胞的生物学特性、致瘤性及对免疫细胞的体内外趋化作用。利用重组腺病毒载体携带hMIP-1β基因(AdhMIP-1β)转染CT26细胞。X-gal染色法检测基因转染效率;ELISA法检测基因转染CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)的趋化作用。小鼠皮下接种转染hMIP-1β基因的CT26细胞,观察其体内致瘤性和对免疫细胞的趋化作用。结果显示,腺病毒载体可携带hMIP-1β基因转染CT26细胞并高效表达hMIP-1β(P<0.01),培养上清含hMIP-1β且对免疫细胞有明显趋化作用。转染hMIP-1β基因的CT26细胞皮下接种后成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润。提示hMIP-1β基因转染CT26细胞后,通过分泌hMIP-1β趋化淋巴细胞等免疫细胞到肿瘤局部发挥有效的抗肿瘤作用,从而为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和策略。     

IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响

目的:分析转染IL-18基因后,对小鼠卵巢癌OVHM细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法:将逆转录病毒携带的小鼠IL-18基因成功转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型(OVHM)作为对照.分别采用MTT、FCM检测体外培养细胞的增殖、凋亡及周期分布.于裸鼠皮下分别接种细胞,观察各组种植瘤生长情况,计算成瘤率;RT-PCR检测瘤组织中IL-18 mRNA表达;FCM和电镜分析肿瘤细胞增殖、凋亡状况.结果:3组细胞的体外增殖未见明显差异,均无明显凋亡现象,增殖指数、细胞周期分布均无明显差异(均P>0.05).接种后,3组裸鼠的成瘤率相同,但OVHM/IL-18组成瘤时间较晚,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢,瘤组织中IL-18 mRNA阳性表达.OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,增殖指数明显降低,凋亡指数明显增高(P<0.01).结论:IL-18基因成功转染后,虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性,但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径,通过阻断细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤.     

联合应用IL-2及IL-4基因转染瘤苗对实验性肺转移肿瘤的治疗作用

将IL—2基因转染的高分泌IL—2的B16黑色素瘤细胞株(B2)及IL—4基因转染的高分泌IL—4的B16黑色素瘤细胞株(B4)制备成新型瘤苗,用以治疗实验性肺转移荷瘤小鼠,并辅以低剂量环磷酰胺,结果表明,荷瘤小鼠存活期明显延长;肺部转移结节数明显减少;两种瘤苗联合治疗后的疗效较单独使用明显,当辅以低剂量环磷酰胺时治疗效果更加明显。体内免疫功能检测表明,经两种瘤苗联合治疗的荷瘤小鼠脾细胞NK及CTL杀伤活性升高得更加明显,但对LAK活性及腹腔巨噬细胞杀伤活性无明显协同增强作用;脾细胞经诱导后产生的细胞因子中,IL—2含量有所升高。     

小鼠心脏移植保存期间经体外灌注行重组腺病毒基因转染的研究

目的:探讨小鼠心脏移植中,通过在体外保存期间对供心进行灌注,进行重组腺病毒基因转染的方法及效率。方法: 利用小鼠异位心脏移植,在供心保存期间行重组腺病毒灌注,在移植后7 d检测移植物内标记基因的表达情况,并通过免疫组织化学染色检测移植物内免疫细胞的浸润,通过流式细胞仪检测受体淋巴细胞的激活状态。结果: 小鼠供心通过体外灌注进行重组腺病毒基因转导,并在4 ℃保存2 h,复跳率达100%,移植后1周,标记基因表达强度到达峰值。移植物组织结构完整,无明显细胞浸润。受体淋巴细胞的激活状态与空白对照组相比,无明显差异。结论: 小鼠心脏移植保存期间体外灌注可应用于腺病毒基因转染等移植物处理过程。     

新型细胞因子IL-24真核表达载体的构建、表达及其对肿瘤的抑制作用

目的：构建IL-24真核表达质粒，并研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法：采用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-C1-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体外转染HIC细胞，再经激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察其表达，用MTT法检测HIC细胞的体外增殖能力，用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡。小鼠皮下接种转染IL-24真核表达质粒或空载的B16细胞观察其体内致瘤性的变化。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的生长抑制作用。结果：pEGF-C1-IL-24转染HIC细胞后，LSCM可观察到其表达。IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力明显受到抑制．G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24的B16细胞体外致瘤率降低。与对照组相比．IL-24基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制（P〈0.05）。结论：IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。瘤内注射pEGFP-C1-IL-24可抑制肿瘤生长，具有明显的抗肿瘤作用。     

人IL-6基因转染的小鼠黑色素瘤细胞B16-IL-6~ 致瘤性降低的实验研究

应用细胞因子基因转染的瘤苗治疗肿瘤是近年来肿瘤基因治疗的重要进展之一。本研究采用磷酸钙DNA共沉淀法将人IL-6基因转染入B16黑色素瘤细胞中,筛选出一株高分泌IL—6(240U/ml)克隆(B16—IL—6~ ),B16—IL-6~ 细胞体外生长能力减弱,小鼠皮下接种后肿瘤结节形成率降低,生长速度减慢,并对再次接种野生型B16细胞具有抵抗作用。小鼠静脉接种后形成的肺转移结节数显著减少,荷瘤小鼠存活期延长。结果表明IL-6基因转染的肿瘤细胞致瘤性显著下降。并能诱导机体产生抗肿瘤免疫功能。     

异基因型和同基因型MHC Ⅱ类基因转染对小鼠肥大细胞瘤免疫原性的影响

目的 :提高肿瘤细胞的免疫原性。方法 :将异基因型或同基因型的MHCⅡ类基因转染至小鼠肥大细胞瘤P815中 ,用此细胞接种同系小鼠 ,1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型P815细胞 ,观察小鼠的存活情况。结果 :转同基因型MHCⅡ基因的P815细胞接种同系小鼠后 ,4/ 10不成瘤 ,而异基因型MHCⅡ基因转染组 ,10 / 10不成瘤。 1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型的P815细胞 ,同基因型转染组 2 / 4不成瘤 ,异基因型转染组 7/ 10不成瘤。结论 :研究说明MHCⅡ基因转染具有使肿瘤细胞的致瘤性下降、免疫保护能力提高的作用 ;并且异基因型比同基因型MHCⅡ类基因转染的效果更佳。     

IL—6基因转染的瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫功能与效果

经丝裂霉素C体外处理后,将IL-6基因转染的、高分泌的IL-6的B16黑色素瘤细胞制成瘤苗。结果发现,体内注射IL-6基因转染的瘤苗后,小鼠脾脏CTL活性、NK活性及IL-2诱导的LAK活性显著升高。经IL-6基因转染瘤苗体内治疗后,荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长显著减慢、肺转移结节数显著降低、存活期显著延长,若同时合用低剂量IL-2,则上述治疗效果更好。可见IL-6基因转染的瘤苗能有效地通过诱导机体抗肿瘤免疫功能而发挥抗肿瘤作用,与低剂量IL-2合用后,IL-6基因转染的瘤苗的抗肿瘤效果更佳。     

人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染

为构建长期稳定表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,我们首先制备了慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,以及Western blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达,从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因。结果显示:经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,超过95%的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;Western blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。以上结果表明我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定的过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,这为进一步研究α-突触核蛋白的生理功能及其在Parkinson病发病机制中的作用奠定了基础。     

BTLA-HVEM通路阻断对树突状细胞功能影响的体内外研究

目的 探讨阻断BTLA-HVEM(B/T淋巴细胞弱化因子疱疹病毒进入介质)通路对树突状细胞功能的影响和相关免疫学机制.方法 构建小鼠BTLA胞外功能区的真核表达载体psBTLA,转染CHO细胞;HSP70-TC-1肿瘤抗原肽刺激小鼠骨髓来源DCs,流式细胞仪检测处理后DCs表面BTLA、HVEM的表达,同时给予转染了psBTLA质粒的CHO细胞的培养上清处理后,检测DCs表面B7-1的表达,ELISA检测上清中IL-12的分泌;处理后的DCs刺激脾细胞,检测淋巴细胞增殖和细胞因子分泌;检测psBTLA体内转染对宫颈癌细胞系TC-1成瘤小鼠DCs表达B7-1和肿瘤生长的影响.结果 成功构建小鼠BTLA胞外段的真核表达载体psBTLA,获得了稳定转染psBTLA的CHO细胞,在其培养上清检测到BTLA胞外段(sBTLA)的表达.DCs经抗原肽刺激后BTLA、HVEM表达均上调,加入含sBTLA的上清处理后上调B7-1,上清中分泌的IL-12增加,与脾细胞共培养时促进细胞增殖和IL-2、IFN-γ的分泌;体内基因转染psBTLA促进DCs表达B7-1以及抑制肿瘤生长.结论 通过sBTLA阻断BTLA-HVEM共抑制通路,可以进一步促进DCs的功能,更好地激活淋巴细胞,促进抗肿瘤免疫应答.     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达。方法:根据人SLC和IL-2cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞。用Westernblot检测SLC和IL-2的表达。结果:Westernblot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致。结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

IL—2,IL—4基因转染后肿瘤细胞表面ICAM—1分子的表达及其作用

为了进一步研究细胞因子基因转染后肿瘤细胞体内致瘤原性、免疫原性变化的分子机制，将ＩＬ－２、ＩＬ－４基因转染入Ｂ１６黑色素瘤细胞，观察了其体内接种后致瘤原性变化，通过ＦＡＣＳ法检测了其细胞表面粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达水平，分析了其细胞表面ＩＣＡＭ－１表达水平以及它们与肿瘤细胞对ＬＡＫ、ＣＴＬ等免疫效应细胞杀伤敏感性变化的关系。结果表明，ＩＬ－２、ＩＬ－４基因转染后Ｂ１６细胞体内致瘤原性明显     

猪苓多糖对S180细胞培养上清免疫抑制作用影响的研究

目的 :研究猪苓多糖对肿瘤细胞系S180培养上清免疫抑制作用的影响。方法 :用MTT比色法检测有或无猪苓多糖作用的肿瘤细胞S180培养上清 (简称肿瘤上清 ) ,对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖和IL 2产生 ,对小鼠脾细胞的杀伤活性 ,以及对CTLL 2细胞对IL 2反应性的影响。用流式细胞仪检测该培养上清对小鼠脾细胞表面IL 2Rα表达的影响。结果 :无猪苓多糖作用的肿瘤上清可强烈抑制上述 5项指标 ;而猪苓多糖作用的肿瘤上清则可明显上调上述方法中所测 5项指标。若先用含猪苓多糖培养液培养肿瘤细胞 2 4h或 48h ,而后洗去或不洗去猪苓多糖 ,再培养肿瘤细胞 2 4h ,所获肿瘤上清也可明显上调上述 5项指标。结论 :猪苓多糖可抵消肿瘤上清的免疫抑制作用 ,下调肿瘤细胞S180合成和 /或分泌免疫抑制物质     

Luciferase activity as a marker of tumor burden and as an indicator of tumor response to antineoplastic therapyin vivo

The gene encoding firefly luciferase has been used as a reporter gene for the study of gene function. The luciferase catalyzes its substrate and subsequently produces luminescence. In addition, it is not present in mammalian cells. We have therefore explored its use in monitoring the growth of tumorsin vivo. The luciferase gene was transfected into two murine tumor lines, i.e. cl62 melanoma and M109 lung carcinoma, and the luciferase activity associated with the cells was determined by a rapid chemiluminescent reaction. Luciferase activity was well-correlated with the number of tumor cellsin vitro. Luciferase activity also correlated with the tumor burdenin vivo, as well as with the effect of an adoptive T cell transfer therapy in the syngeneic C3H/HeN mice experimental tumor model. This assay offers the advantage of being quantitative, rapid, and reliable for the detection of tumor burden and for the evaluation of the effect of antineoplastic therapy.