DADS诱导人胃癌细胞周期阻滞相关基因的差异表达

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞相关基因表达的变化。方法MTT法、流式细胞术分别分析DADS对MGC803细胞的抑制作用与细胞周期分布的影响;功能基因芯片检测周期相关差异表达基因;Western blot、RT-PCR验证周期相关基因的表达。结果MTT法、流式细胞术证明DADS可明显抑制MGC803细胞增殖并诱导G2/M期阻滞。基因芯片结果显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞4 h后,表达上调的基因有CDC45L、CDK5R1、p21、CUL4A、GADD45α、RAD17、TP53,下调的基因是ANAPC5、ATR、BRCA1、CCNA2、CCNB2、CCNE1、CCNE2、CDC16、CDC6、CDK5RAP1、GTF2H1、MCM5、RAD9A、RGC32。RT-PCR显示30 mg.L-1DADS处理MGC803细胞4、8、12 h后,p21、GADD45α时间依赖性的表达增强(P<0.05),CyclinB1呈时间依赖性的表达降低(P<0.05)。TP53在4、8、12 h后与对照组比较表达明显增强(P<0.05)。Western blot结果表明,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24 h后,p53、GADD45α、p21蛋白表达上调,CyclinB1蛋白表达下调(P<0.01)。结论DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞是由多基因协同作用的结果,可能通过两种途径共同调节完成的。     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G_2/M期的阻滞作用

目的　探讨二烯丙基二硫 (DADS)对人胃癌MGC80 3细胞G2 /M期的阻滞作用及分子机制。方法　体外培养MGC80 3细胞 ,采用MTT比色实验、细胞计数法 ,流式细胞光度术和Westernblot分析DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用 ,细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白的表达。结果　MTT法显示 ,2 0mg·L-1DADS、30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 72h后 ,生长抑制率分别达2 5 7%、5 8 6 %。细胞计数法表明常规培养MGC80 3细胞群体倍增时间为 2 9 92h ,30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞后 ,其细胞群体倍增时间延长到 5 5 5 8h。流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将MGC80 3细胞阻滞在G2 /M期。 30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 36h ,与对照组相比 ,可使G2 /M期细胞增加到 4倍多。Westernblot分析表明在G2 /M期阻滞同时有Cdc2 5C蛋白表达下降 ,但CDK1蛋白表达不受DADS作用的影响。结论　DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用与G2 /M期阻滞有关 ,DADS对MGC80 3细胞G2 /M期阻滞的分子机制可能与降低Cdc2 5C蛋白水平有关     

紫杉醇对U373细胞周期阻滞及增殖抑制的机制研究

目的研究紫杉醇(PTX)诱发神经胶质瘤U373细胞的周期阻滞和增殖抑制的相关机制。方法 MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫细胞荧光化学观察细胞形态学变化,RT-PCR和Western blot检测细胞周期相关CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK2和p53的表达变化。结果 PTX可以明显抑制U373细胞的增殖活性,抑制作用呈时间浓度依赖性;细胞周期分析显示,实验组细胞G2/M期比例增高;细胞免疫荧光检测实验组细胞阻滞于有丝分裂期;RT-PCR和Western blot显示,PTX可以增加CDK1和CyclinB1表达,降低CyclinD1表达(P<0.05),而对CDK2无明显影响。结论 PTX能够抑制神经胶质瘤U373细胞增殖,引起有丝分裂期阻滞,诱导细胞凋亡,与其细胞周期相关蛋白表达水平密切相关。     

二烯丙基二硫对人结肠癌HT-29细胞G_1期的阻滞作用

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人结肠癌HT-29细胞G1期的阻滞作用及分子机制。方法采用MTT、细胞计数法、流式细胞术和免疫细胞化学方法分析DADS对体外培养的HT-29细胞增殖抑制作用、细胞周期分布及细胞周期相关蛋白表达的影响。结果MTT法显示,60、120μmol.L-1DADS作用HT-29细胞24 h后,生长抑制率分别达23.1%、45.6%。细胞计数法表明,常规培养HT-29细胞群体倍增时间为22.58 h,60μmol.L-1DADS作用HT-29细胞后,其细胞群体倍增时间延长到31.20 h。流式细胞仪分析结果显示,60μmol.L-1DADS阻滞HT-29细胞在G1期,与对照组相比,可使G1期细胞增加约2倍,而120μmol.L-1DADS显著地将细胞阻滞在G2/M期。免疫细胞化学分析表明在G1期阻滞同时有p21W af1蛋白表达上调,Cyc lin E、C-myc蛋白表达下降。结论低剂量DADS对HT-29细胞的抑制增殖作用可能与G1期阻滞有关,DADS对HT-29细胞G1期阻滞的分子机制可能与调节p21W af1、Cyc lin E、C-myc表达相关。     

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对K562细胞分化和细胞周期的影响

目的本研究探讨新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)对K562细胞株的抑制增殖和诱导分化活性并对其机制进行研究。方法ATPR作用于K562细胞3d后,通过MTT法检测细胞的增殖,NBT还原实验法分析细胞的分化指标,瑞氏染色法在油镜下观察加药前后细胞形态学变化,FCM检测分析细胞周期,RT-PCR法检测cyclinE、cyclinD1、CDK2、CDK4、CDK6、p21cip1、p27kip1、p57kip2和PCNA mRNA的变化情况。Western blot法检测cyclin D1和CDK4蛋白表达的改变。结果ATPR呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖的作用。ATPR诱导分化活性表现为NBT阳性细胞率增加,油镜下观察K562细胞有分化成熟的改变,G0/G1期细胞表达量增加,S期细胞表达量减少,呈G1期阻滞。RT-PCR检测发现cyclin E、cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6表达减少,PC-NA、P21cip1、P27kip1改变不明显,P57kip2表达增加。Western blot检测cyclin D1和CDK4蛋白表达减少。结论ATPR有较强的抑制K562细胞增殖并诱导其分化的活性,并通过上调P57kip2的表达,抑制Cyclin-CDK激酶复合物,发挥细胞周期阻滞的作用。     

二烯丙基二硫抑制SW480细胞系生长增殖的相关蛋白质分子鉴定

目的应用前期比较蛋白质组学筛出的部分差异表达蛋白质分子,进行进一步分析与鉴定。方法采用MTT法,观察不同浓度和作用时间DADS对SW480细胞的生长抑制作用;使用流式细胞仪,分析50 mg.L-1DADS对SW480细胞的周期分布的影响;运用Western blot方法,分析50 mg.L-1DADS处理SW480细胞系后泛肽和FKBP的表达水平。结果MTT法显示,DADS能明显抑制SW480细胞系生长增殖,呈浓度和时间依赖性,SW480细胞系经不同浓度DADS处理后,生长增殖速度明显减慢。流式细胞仪分析结果显示,50 mg.L-1DADS将SW480细胞阻滞在G2/M期。应用Western blot分析结果显示,50 mg.L-1DADS处理SW480细胞48 h,泛肽表达较对照组增强,而FKBP的表达明显降低,差异均为2倍以上。结论DADS抑制SW480细胞系生长增殖,可能与泛肽表达上调,FKBP表达下调,将细胞阻滞在G2/M期有关。     

蜂毒素对人胚肺成纤维细胞生长的抑制作用及其机制探讨

目的研究蜂毒素(melittin)对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)生长的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测蜂毒素对MRC-5细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR法检测细胞中Cyclin D1、CDK4及E2F-1mRNA的表达变化;Western blot法检测Cyclin D1、CDK4、p21及E2F-1蛋白表达。结果与对照组比较,蜂毒素处理组细胞增殖明显受到抑制,并呈剂量和时间依赖性(P<0.05);流式细胞仪检测结果发现,随着浓度的增大,G0/G1期细胞百分比逐渐上升,S期细胞百分比逐渐下降;同时Western blot结果提示蜂毒素(1,2,4 mg.L-1)可以明显降低Cyclin D1、CDK4及E2F-1表达,而上调p21表达。结论蜂毒素能抑制MRC-5细胞增殖,其机制可能与干扰该细胞G0/G1期相关基因的转录相关且抑制Cyclin D1/E2F信号转导。     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G_2/M期检查点Chk1与Chk2的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响。方法流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Westernblot与免疫细胞化学检测DADS处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达。结果流式细胞术分析显示,30 mg.L-1DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期(P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性(P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05)。结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关。     

二氢青蒿素对体外培养胃癌细胞株BGC-823周期蛋白D1 P16蛋白表达的影响

目的探讨二氢青蒿素(DHA)对人胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用及周期蛋白D1、P16蛋白表达的影响。方法以25～100μmol/L DHA干预人胃癌细胞株BGC-823细胞后通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖率,吖啶橙-溴化乙定(AO-EB)染色观察细胞凋亡情况、流式细胞仪检测细胞凋亡周期、蛋白质印迹法检测细胞中周期蛋白D1、P16蛋白表达情况。结果 DHA对人胃癌细胞具有时间、浓度依赖性抑制作用;且浓度依赖性阻滞细胞周期,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少(P<0.05)。DHA浓度依赖性下调cyclin D1蛋白,上调p16蛋白的表达(P<0.05)。结论 DHA通过下调cyclin D1蛋白,上调p16蛋白的表达,调节细胞周期调控通路,阻滞细胞于G0/G1期,有效抑制人胃癌细胞的增殖。     

shRNA介导的Iduna沉默对肺癌A549细胞系细胞周期及其相关蛋白表达的影响

目的利用shRNA沉默E3泛素连接酶Iduna基因,观察Iduna对非小细胞肺癌细胞系A549细胞周期及其相关蛋白表达的影响。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法筛选Iduna高表达细胞系。构建shRNA-Iduna真核表达载体,瞬时转染A549细胞,蛋白印迹法检测转染效率。流式细胞仪检测细胞周期变化。蛋白印迹法检测细胞周期相关蛋白的表达。结果蛋白印迹法筛选Iduna高表达细胞系显示A549和SPC细胞中Iduna mRNA和蛋白水平高于其他细胞系。shRNA-Iduna转染A549细胞系后,流式细胞仪检测细胞周期显示干扰组G0/G1期比例增加,S期比例相对减少(P<0.05)。蛋白印迹法检测与细胞周期相关的G1/S期调控蛋白[细胞周期蛋白(cyclin)A、cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、P21、P27、P53等]的表达情况,结果显示干扰组cyclin D1、cyclin E和CDK4蛋白表达减少(P<0.05)。结论 Iduna可能通过调控cyclin D1、cyclin E和CDK4蛋白的表达,使细胞阻滞于G0/G1期,从而调节肺癌细胞周期进程。     

一种选择性环氧化酶2—抑制剂JTE—522抑制RL95—2细胞的增殖及诱导其凋亡

目的:探讨环氧化酶-2抑制剂JTE-522是否对人子宫内膜癌细胞株RL95-2细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用及其分子机理.方法:应用体外噻唑兰法、琼脂糖凝胶电泳、酶联免疫试验、流式细胞术、RT-PCR及Western blot等方法研究JTE-522对RL952细胞增殖和凋亡的作用及其分子机理.结果:JTE522抑制RL95-2细胞的增殖、诱导其凋亡、引起G_0/G_1期阻滞和 S期抑制,并伴有COX-2 mRNA、磷酸化 Rb、CDK4蛋白表达的抑制及 p53,p21和cyclin D_1蛋白表达水平的上调.另外,细胞经 JTE-522处理后,还可见caspase-3活性的增加.结论:JTE-522抑制RL95-2细胞的增殖及诱导其凋亡,可能与COX-2mRNA,磷酸化Rb、CDK4蛋白水平的下降及 p53,p21和 cyclin D_1蛋白表达的上调有关,还可能与caspase-3的激活有关.     

Alteronol inhibits proliferation in HeLa cells through inducing a G1-phase arrest

Objectives Alteronol is a novel compound purified from fermentation products of a microorganism in the bark of the yew tree. The study was designed to evaluate the anticancer effects of alteronol. Methods Human cervical carcinoma cell line HeLa was cultured in vitro. The cell viability was evaluated by using sulforhodamine B assay. The cell cycle distribution was analysed by flow cytometry. The level of cyclin D1 protein was evaluated using Western blot analysis. The changes in cyclinD1, CDK4 and p21 were detected by ELISA assay and the changes in G1‐related regulators were detected by RT‐PCR assay. Key findings Our data showed that alteronol inhibited the proliferation of HeLa cells and induced G1 phase arrest. Downregulation of the mRNA levels of CDK2, CDK4 and cyclin D1 and upregulation of p21 in alteronol‐treated cells were observed. Conclusions Downregulation of the mRNA levels of CDK2, CDK4 and cyclin D1 and upregulation of p21 might be a possible mechanism for the inhibition of proliferation induced by alteronol in HeLa cells.     

二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞迁移侵袭及LIMK1表达的影响。方法MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对MGC803细胞增殖、迁移与侵袭能力的作用;RT-PCR、Western blot与免疫细胞化学检测LIMK1表达。结果 MTT显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后,增殖抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%、89.2%,呈明显的时间依赖关系(P<0.05)。划痕实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS分别作用MGC803细胞,划痕愈合明显慢于对照组,呈剂量依赖关系(P<0.05)。侵袭实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24 h后,穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个,较对照组(39.5±2.99)个数明显减少,呈剂量依赖性(P<0.05)。RT-PCR显示,30 mg.L-1DADS与MGC803细胞作用48 h后,LIMIK1mRNA明显下调(P<0.05)。Western blot与免疫细胞化学检测显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24、48h后,LIMK1蛋白的表达水平呈时间依赖性下降(P<0.05)。结论 DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调LIMK1有关。     

神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡

目的　了解第二信使神经酰胺信号转导对鼻咽癌细胞生长的影响。方法　采用MTT法检测神经酰胺对鼻咽癌细胞株 (CNE 2 )增殖的抑制作用。光镜观察、荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变。Westernblot法检测p2 1WAF1的表达。结果　神经酰胺在 6 2 5、12 5、2 5、5 0 μm浓度下 ,对CNE 2细胞生长有明显的抑制作用 ,流式细胞仪检测发现亚G1峰出现 ,荧光染色可见核荧光强度增加、核片段化和凋亡小体。p2 1WAF1蛋白表达明显上调。结论　神经酰胺能诱导鼻咽癌细胞株CNE 2凋亡 ,且上调 p2 1WAF1蛋白表达。p2 1WAF1可能是神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡中起作用的因素之一。     

舒尼替尼对EGFR TKI抵抗的A549细胞株增殖抑制作用及机制研究

目的探讨舒尼替尼(sunitinib)体外对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)耐药的非小细胞肺癌A549细胞的生长抑制作用及其机制。方法 MTT法检测sunitinib对A549细胞的生长抑制作用;荧光显微镜观察sunitinib诱导的细胞凋亡;流式细胞术检测sunitinib作用后细胞周期变化;Western blot检测sunitinib作用后Bcl-2蛋白水平的变化。结果在0.4～12.8μmol.L-1浓度范围内,sunitinib抑制A549细胞增殖,且具有浓度和时间依赖性,24、48、72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(7.34±0.76)、(5.54±0.62)、(3.68±0.53)μmol.L-1。荧光显微镜观察发现sunitinib能够诱导细胞出现核固缩、体积缩小等凋亡形态学改变。细胞周期显示sunitinib将A549细胞阻滞于G0/G1期。Western blot显示sunitinib能够降低Bcl-2蛋白的表达水平,且随着sunitinib浓度的升高,Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低。结论 sunitinib能够抑制EGFR TKI抵抗的A549细胞生长,并具有浓度和时间依赖性,其抗肿瘤的机制可能与诱导细胞周期阻滞和下调Bcl-2的表达有关。