冰冻切片免疫荧光中组织固定方法研究

目的通过对3种不同固定液对肝组织冰冻切片免疫荧光过程中固定情况的比较,探寻保存抗原最佳固定效果的方法。方法取Wistar大鼠肝脏,OCT包埋后置于冰冻机切片,片厚8～10μm。分别用10%甲醛、丙酮和1%多聚甲醛3种固定液固定后,进行免疫荧光染色,经Image-pro图像分析软件及单因素方差分析统计,比较其染色效果。结果丙酮固定的肝组织的免疫荧光组织结构清晰,核浆对比度好,其Heppar肝细胞抗原的阳性面积为(73.2±1.2)%,与10%甲醛(46.2±1.5)%及1%多聚甲醛(62.2±1.1)%固定的肝组织比较差异有统计学意义。结论在保存肝组织中抗原活性方面,相对于10%甲醛和1%多聚甲醛液,以丙酮固定液固定效果最好。     

脂肪组织切片制备方法的改进

目的探讨脂肪组织石蜡切片及冰冻切片方法的改进。方法取脂肪组织迅速固定于10%中性福尔马林中,设置不同的脱水程序制备石蜡切片,HE染色。免疫组化法观察PPARγ和ITLN1的表达。取脂肪组织迅速固定于甲醛钙或10%中性福尔马林固定液中24 h以上,OCT包埋,置于-80℃冰箱至少30 min,设置冰冻切片机箱体温度-20℃,样品头温度-30℃,切片后HE染色。结果用改进方法制备的脂肪组织石蜡切片,切面平整,无皱褶,无裂隙,脂肪细胞结构完整,染色清晰,且对免疫组化结果无影响;冰冻切片的改进提高了切片质量,结构完整,形态好,染色清晰。结论改进的脂肪组织石蜡切片和冰冻切片均可成功应用于不同实验动物,为脂肪组织的研究提供了有力的支撑条件。     

三种固定液对神经纤维冰冻切片固定效果之比较

目的:观察比较10%甲醛、丙酮和Bouin三种固定液对神经纤维的固定效果,为临床做出更好的神经纤维的快速冰冻切片提供实验基础.方法:取健康大鼠双侧坐骨神经,冰冻切片后分别用三种固定液固定,然后做HE染色,观察各自的组织结构及染色情况.结果:10%甲醛固定的神经纤维组织结构较清楚但是组织发生收缩;丙酮固定的神经纤维染色效果较好,组织没有发生收缩;Bouin固定液固定的神经纤维结构和染色都比较好但是组织收缩最明显.结论:三种固定液都可用于固定神经纤维,但丙酮效果最好.     

蔗糖磷酸缓冲液对组织标本中RNA的保护作用

目的探讨蔗糖磷酸缓冲液作标本保存剂对组织标本中核酸的影响。方法分别用25％蔗糖磷酸缓冲液，10％中性甲醛(40℃-100~C)固定保存小鼠组织4—48h后，检测其组织结构及RNA完整性和特异性扩增产物。结果组织经25％蔗糖磷酸缓冲液保存，冰冻切片HE染色后组织结构清晰；从中提取的RNA完整性与立即冰冻保存的组织无明显区别。结论25％蔗糖磷酸缓冲液固定标本48h，既能保持组织结构完整又不影响组织标本的RNA提取和扩增。     

常见组织快速冰冻切片技术探讨

目的探讨提高冰冻切片质量的技术和方法.方法新鲜活体组织取材,根据组织大小、形态结构和性质组成调解适当温度冷冻后切片,切片制成后立即放入酒精中固定,HE染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片.结果切片完整,厚薄均匀,染色鲜艳,核浆对比鲜明,符合术中快速冰冻诊断要求.结论一张优质的冰冻切片需对不同组织区别对待,从取材、冷冻、切片、固定、染色等环节认真做起.     

不同固定液对延迟处理标本的HE制片的影响

目的：观察比较10%甲醛、10%甲醛冰醋酸1：1的混合液及丙酮三种固定液对延迟固定标本的固定效果,为临床病理做出更好的延迟固定标本切片提供实验基础。方法：取术中送检标本80例,分别延迟24、48、72h后,相同延迟固定时间标本分别用三种固定液固定,然后做HE染色,观察各自的组织结构及染色情况。结果：同一延迟固定时间,甲醛固定的组织结构自溶现象最显著,染色黯淡;混合固定液自溶现象相对较轻,染色效果优于甲醛;丙酮固定的组织结构自溶现象最轻,染色效果最好。且延迟固定时间越久,变化越显著。结论：三种固定液都可用于固定延迟固定标本,但丙酮效果最好。     

石蜡包埋肾组织免疫荧光染色在病理诊断中的应用

目的 探讨石蜡包埋肾组织做免疫荧光是对冰冻切片肾组织做免疫组化的一个补充手段.方法 采用石蜡切片进行脱蜡,修复抗原直接免疫荧光染色,将染色结果与冰冻切片染色结果进行比较.结果 石蜡包埋肾组织与冰冻切片染色的诊断符合率达100%,而石蜡切片具有组织结构保存好,免疫沉积物清晰、易于判断结果及免疫荧光淬灭时间长等优点.结论 石蜡切片免疫荧光染色可做为冰冻切片免疫荧光染色的补充手段.     

石蜡包埋肾组织免疫荧光染色在病理诊断中的应用

目的探讨石蜡包埋肾组织做免疫荧光是对冰冻切片肾组织做免疫组化的一个补充手段。方法采用石蜡切片进行脱蜡，修复抗原直接免疫荧光染色，将染色结果与冰冻切片染色结果进行比较。结果石蜡包埋肾组织与冰冻切片染色的诊断符合率达100％，而石蜡切片具有组织结构保存好，免疫沉积物清晰、易于判断结果及免疫荧光淬灭时间长等优点。结论石蜡切片免疫荧光染色可做为冰冻切片免疫荧光染色的补充手段。     

术中冰冻切片290例病理诊断分析

<正> 我院自1984年2月开始,间断开展冰冻切片快速病理诊断,至1997年10月资料较完整的病例共有290例。为了总结经验教训,提高快速病理诊断准确性,笔者对此进行了总结,以供同道参考。 1 材料与方法 手术中送检的新鲜组织取材后,用德国Leica冰冻切片机制片,制冷温度为—20℃以下,根据标本种类适当调节制冷温度,切片经过快速固定,HE染色,光镜观察15—30分钟内向手术室临床医生发出冰冻切片病理诊断报告。冰冻剩余组织及手术结束     

消除小鼠肝脏冰冻切片自发荧光4种封闭方法的比较

目的 通过对小鼠肝脏冰冻切片进行不同的封闭处理,探寻消除小鼠肝脏自发荧光的最佳方法,以降低对免疫荧光阳性信号的干扰,提高免疫荧光结果的准确性。方法 （1）经脾静脉注射肝脏荷瘤裸小鼠：将Hepa1-6-GFP细胞通过脾脏注射方法使其在雄性无胸腺BALB/c裸小鼠肝脏定植,并将肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行AB液（内源性生物素封闭液）、blocking、AB液+blocking、丙酮+AB液+blocking封闭处理,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。（2）C57BL/6小鼠：对C57BL/6小鼠肝脏进行冰冻连续切片,对切片分别进行上述4种封闭处理,用F4/80标记肝巨噬细胞（Kupffer细胞）,然后检测小鼠肝脏冰冻切片自发荧光。结果 肝脏组织冰冻切片免疫荧光染色时,4种封闭处理都可以减弱肝脏切片的自发荧光,但丙酮+AB液+blocking封闭处理效果最佳。结论 丙酮+AB液+blocking联合应用对小鼠肝脏组织冰冻切片自发荧光的消除效果最好。     

固定时间对乳腺癌快速冰冻切片免疫组化结果的影响

目的分析固定时间对乳腺癌冰冻切片免疫组化结果的影响，探寻最佳的固定时间。方法利用AAF固定液（配方为丙酮85mL、冰醋酸5mL、40％甲醛10mL）以1min、2min、4min、6min、8min、10min、12min、15min不同时间对乳腺癌组织冰冻切片进行固定，然后利用6种乳腺癌相应抗体进行免疫组化染色，根据2004—2008年全国十次免疫组化质控活动所用的免疫组化质控评分标准对图像质量进行评分量化。结果固定时间可以直接影响乳腺癌冰冻切片免疫组化图像的质量，最佳的固定时间为6～8min。结论对乳腺癌冰冻切片固定6～8min可取得质量最高的免疫组化结果。     

大鼠视网膜、视神经冰冻切片适宜厚度探索

目的 针对大鼠眼球冰冻切片难度高,各研究对眼球冰冻切片厚度差异较大的问题,探索大鼠视网膜、视神经冰冻切片适宜的厚度.方法 将24只SD大鼠随机分为3组,使用传统的石蜡切片行HE染色做对照,分别对不同厚度的冰冻切片做HE染色和FITC-lectin荧光染色进行观察（5μm、6μm、8μm、10μm、12μm、15 μm,n=8）.结果 视网膜冰冻切片HE染色显示6μm和8μm的大鼠视网膜各层细胞可看到完整细胞,密疏适宜,胞核清楚,核膜光滑完整,神经纤维层厚度均匀;6μm视神经冰冻切片HE染色显示视神经纤维排列密集、规则,染色均匀;免疫组化染色结果显示5μm、6μm和8μm的大鼠视网膜冰冻切片FITC-lectin荧光染色后层次清晰,lectin阳性细胞呈绿色分枝状,在神经节细胞及内网状层清晰可见,亦可在外网状层看到少量绿色lectin阳性细胞,10 μm及15 μm的大鼠视网膜由于各层细胞重叠严重,无法看到绿色lectin阳性细胞.6μm的视神经冰冻切片FITC-lectin荧光染色显示清晰可见的活化小胶质细胞,胞体变肥大,突起缩短,呈阿米巴样变化.结论 6 μm的视神经冰冻切片以及6～8 μm的视网膜冰冻切片,可以得到重复性切片,也可以达到理想的免疫组化染色效果。     

增殖细胞核抗原PCNA在大鼠缺血再灌注脑组织中的表达

目的:研究大鼠全脑缺血再灌注后增殖细胞核抗原PCNA的表达时程及其与凋亡的关系。方法:采用4-VO法建立全脑缺血再灌注损伤模型,将各组各时间点脑组织切片分别进行HE染色:光镜下观察海马回CA1区神经元形态结构改变;免疫组化染色:观察PCNA蛋白在CA1区的表达情况;TUNEL染色:观察海马回CA1区神经细胞凋亡情况,统计阳性细胞表达情况,计算细胞凋亡指数;将PCNA蛋白免疫组化切片进行图象分析测得平均灰度值。结果:PCNA蛋白于再灌注后2h在海马CA1区可见表达下降,再灌注后6～24h组明显下降,之后持续低表达。缺血再灌注后6h凋亡细胞开始增加,主要位于CA1区,24～48h为高峰,至72h明显减少。结论:PCNA蛋白主要在缺血再灌注后早期即24h前DNA损伤未积累到严重程度时执行抗凋亡的作用,对损伤神经元进行修复。     

间接荧光抗体试验诊断实验性旋毛虫病的研究

本文应用间接荧光抗体试验比较了４种方法制备的旋毛虫幼虫抗原诊断实验性旋毛虫病的效果。结果表明，旋毛虫纯净幼虫冰冻切片抗原优于完整幼虫抗原、超声粉碎幼虫抗原及膈肌幼虫冰冻切片抗原。用此抗原检测感染旋毛虫的大鼠血清时，抗体阳性率为１００％（１３／１３），而１０份正常大鼠血清均为阴性反应。小鼠感染旋毛虫后２周即可检测到抗旋毛虫抗体，阳性率为１１．１１％（１／９），感染后５周抗体阳性率已升到１００％（８／８），升高的抗体滴度可一直持续至感染后第１５周。此抗原在－２０℃至少可保存２．５年而不丧失其活性和特异性。应用滤纸血也可取得满意的检测结果。     

用于免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作体会

目的：探索适合免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作方法与技巧.方法：将SD大鼠麻醉后灌注或不灌注取眼球,根据标本处理差异分别进行固定及脱水处理,制作不同厚度视网膜冰冻切片60例,进行免疫荧光抗体标记,利用荧光显微镜观察其细胞排列及标记状况.结果：完整眼球视网膜结构形态可保持相对规则,但偶尔发生组织牵拉;玻璃体去除的视杯标本免疫荧光染色结果相对理想.标本厚度介于10～12 μm冰冻切片视网膜血管免疫荧光染色结果优于其他厚度者.结论：用于免疫荧光的组织标本应尽量保持其完整的固有形态,通过对目标结构的定性、定位以及定量,再现视网膜各成分的状态.实验者可根据需要选择最适合的眼组织取材方法、切片厚度等以便得到满意的观察效果.     

地塞米松对脊髓损伤后TNF-α和IL-6表达的影响

目的：探讨实验性大鼠脊髓挫伤后,急性期炎症因子：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）在脊髓内的表达变化以及地塞米松对其表达的影响。方法：采用改良Allen’s法建立大鼠脊髓（T12）损伤模型,90只SD大鼠随机分成正常组（n=6）、SCI组（n=42）和DEX组（n=42,于SCI后15min尾静脉注射DEX30mg/kg）,分别于损伤后1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h取材,做常规HE染色和用抗TNF-α和抗IL-6行免疫组织化学方法染色。结果：TNF-α和IL-6在正常大鼠脊髓组织不表达;TNF-α、IL-6在脊髓损伤后1h均有表达,于48小时回落到正常。TNF-α在24h达高峰;IL-6在12h达高峰。地塞米松干预后二者均受到明显抑制。结论：大剂量地塞米松对TNF-α、IL-6有明显的抑制作用。     

固定方式对神经细胞膜NMDAR1免疫细胞化学定位的影响

目的 探讨不同固定方式对神经细胞膜NMDA受体NR1亚基免疫细胞化学定位结果的影响,并确定NR1在膜上的亚细胞定位分布。方法 采用免疫细胞化学ABC法观察不同固定方式分组时NR1亚基在神经元膜上的定位分布。结果 -20 ℃纯甲醇和-20 ℃纯丙酮固定5 min组呈现NR1典型的细胞膜阳性染色,定位在神经元两极靠近树突起始部及树突干上。4%多聚甲醛及加上0.5%戊二醛固定20 min组呈现染色假阴性。95%乙醇固定10 min组呈现细胞膜染色假阴性,细胞核染色假阳性。结论 每种抗原免疫细胞化学检测中都有各自最适合的固定方法。NMDAR1抗原需要应用缓和的固定方式,-20 ℃纯甲醇和-20 ℃纯丙酮5 min短时间固定效果最好。NMDAR1分布于神经元膜两端树突起始部及树突干上。     

不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响

目的 比较不同的固定方法对细胞内胞浆蛋白Vigilin和核蛋白CTCF的免疫荧光染色结果的影响.方法 在免疫染色前,分别采用四种方法对HepG2细胞进行固定及通透：①纯甲醇-20℃处理8min后,再用80％丙酮—20℃处理1min.②甲醇;丙酮的1∶1混合溶剂-20℃处理10min.③在方案2的基础上,再用0.1％ Triton-X-100冰上通透10min.④4％多聚甲醛室温固定10min后,用0.1％％Triton-X-100冰上通透10min.结果 采用方案①、②、③、④得到的胞浆蛋白vigilin在细胞内的大致分布无明显差异,但用方案④处理后,染色效果更为清晰而能更好地观察到细胞的细微结构;另外,采用方案①和方案②处理细胞后,对核蛋白CTCF进行免疫染色,可见CTCF分布于胞浆;方案③中,在纯甲醇固定后,若用0.1 ％Triton-X-100通透,则CTCF显示主要分布于细胞核内,胞质内亦有阳性染色;方案④的通透条件下,CTCF特异性分布于细胞核,胞质内几乎无阳性染色.结论 不同的固定及通透方法对免疫染色的结果影响很大,应针对抗原特点,采用适宜的固定方法,以得到正确的实验结果.