RNAi沉默survivin基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4 DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化.结果 酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的EJ细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论 重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.     

Livin siRNA重组腺病毒对胶质瘤U251细胞的增殖、凋亡的作用研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)沉默livin的表达,探讨其对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法制备livin siRNA重组腺病毒后感染U251细胞,采用RT-PCR、蛋白质印迹法检测livin基因的干扰效果,用MTT法和流式细胞术检测U251细胞的增殖和凋亡情况。同时观察重组腺病毒对荷瘤小鼠的治疗效应。结果重组腺病毒Ad-livin siRNA能有效抑制U251细胞的livin mRNA和蛋白水平的表达;抑制U251细胞增殖,促进凋亡;在小鼠体内有效抑制U251细胞的生长和提高荷瘤小鼠的平均生存期（P<0.05）。结论用livin siRNA重组腺病毒介导抑制livin基因的表达,可抑制U251细胞增殖,促进凋亡,为胶质瘤的治疗提供了新策略。     

RNA干扰技术阻断EJ细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pSilencer2.0构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染膀胱肿瘤细胞系EJ,通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达.方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与psilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体有效地阻断了EJ细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),其中pSilencer2.0-SVV2重组载体干扰效果更佳.结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2,两者均可有效地阻断膀胱癌细胞系EJ细胞中survivin基因的表达,pSilencer2.0-SVV2重组载体效果更佳,这为后继实验研究打下基础.     

livinβ对胶质瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的探讨livinβ基因阻断对胶质瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法脂质体法转染重组质粒于人星形胶质瘤细胞(U251),MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡值,RT-PCR、Western blot分别检测细胞中caspase-3基因及蛋白的表达。结果 MTT法检测转染组细胞增殖明显低于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.05);PI单染流式细胞术检测转染组细胞凋亡值明显低于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.05);转染组caspase-3基因及蛋白表达均明显高于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阻断人星形胶质瘤细胞(U251)中livinβ基因表达,caspase-3基因及蛋白表达均明显增加,激活细胞凋亡蛋白酶级联反应,导致凋亡增加,细胞增殖减少,进一步证实了livinβ基因在胶质瘤的发生、发展中起着重要作用。     

PTEN基因重组腺病毒载体对脑胶质瘤U251生长和凋亡的影响

目的探讨PTEN基因对人脑胶质瘤细胞株U251生长及凋亡的影响。方法携带PTEN基因的重组腺病毒载体转染U251细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测Ad-PTEN-GFP组及Ad-GFP及Control组中PTEN mRNA及蛋白水平表达,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等变化,Western blot检测细胞蛋白水平表达的变化。结果 Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,经荧光显微镜、PCR和Western blot证实转染成功。Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,细胞生长明显受抑制（P〈0.05）。Ad-PTEN-GFP转染组中p-Akt及P65蛋白水平下降,与Control组相比差异有统计学意义。结论 PTEN基因转染后能抑制人脑胶质瘤U251的生长,调控细胞周期,可能通过PTEN-Akt-NF-кB促进细胞凋亡。     

靶向livin的小分子干扰RNA联合表阿霉素对乳腺癌细胞ZR-75-30凋亡的影响

目的 利用RNA干扰技术阻断livin基因的表达,观察其联合表阿霉素对乳腺癌细胞ZR-75-30凋亡的作用.方法 体外化学合成靶向livin的小分子干扰RNA(siRNA),在脂质体(lipofectamineTM2000)的介导下转染人乳腺癌细胞ZR-75-30.荧光共聚焦显微镜下观察转染效率,半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后ZR-75-30细胞livin基因表达的变化,流式细胞术检测转染靶向livin的iRNA联合表阿霉素作用的ZR-75-30细胞的凋亡率.结果 靶向livin的siRNA可以有效特异地抑制ZR-75-30细胞livin基因的表达,在mRNA水平上其表达抑制率约为53.66%;在蛋白质水平其表达抑制率约为58.32%,转染靶向livin的siRNA 36h后,靶向livin的siRNA联合表阿霉素可以诱导(15.18±0.05)%的细胞凋亡.结论 靶向livin的siRNA能有效、特异地阻断livin基因的表达,阻断livin基因表达联合表阿霉素可促进ZR-75-30细胞的凋亡.     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响

目的: 构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构 (shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用. 方法: 在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Western bloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞. 结果:实时荧光定量PCR以及Western blotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞. 结论: 靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达, 并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，导入人胶质瘤细胞U251中，研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则，在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列，间以9个核苷酸的茎环序列，两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中，获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin；采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251；分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果；采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后，U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达，并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。