2型糖尿病患者肠道菌群两种分子指纹图谱分析研究

目的 利用重复共有序列(ERIC)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)两种分子指纹图谱技术对2型糖尿病患者肠道菌群结构特征分析,探讨2型糖尿病与肠道菌群的相关性及对两种方法的评价。方法 收集8例健康人和7例2型糖尿病患者粪便样本,提取粪便菌群总DNA,采用ERIC-PCR和DGGE-PCR分子指纹图谱技术对两组人群肠道菌群结构分析,比较其多样性、相似性等生态学特征。结果 与健康对照组比较,2型糖尿病患者肠道菌群图谱条带和Shannon-Wiener多样性指数降低,但无统计学意义; 组内相似性降低差异有统计学意义(P＜0.05),菌群结构发生变化; 两种指纹图谱技术均能直观反映肠道菌群结构特征,ERIC方法简便,反映菌群多样性良好,但是实验影响因素较多,不可切胶测序; DGGE能较好反映菌群多样性、相似性等生态学特征,而且可选择条带切胶测序。结论 2型糖尿病患者肠道菌群组成结构发生改变,糖尿病的发生与肠道菌群有一定相关性; ERIC和DGGE是研究肠道菌群分辨效率高、重复性好的指纹图谱技术,DGGE并可进行切胶测序比对鉴定细菌,二者可结合使用。     

维吾尔医学异常黑胆质体液结肠癌患者肠道菌群的分布情况研究

目的通过先进的分子生物学方法分析维吾尔医学异常黑胆质结肠癌患者肠道菌群分布情况及多样性。方法对结肠癌患者进行维吾尔医学体液分型并挑取其中异常黑胆质患者,采集患者粪便样品,提取细菌总DNA并设计一对通用引物扩增16SrDNA的V6~V8可变区进行变形梯度凝胶电泳(DGGE),从DGGE指纹图谱中比较各个结肠癌患者肠道菌群分布情况。结果通过试验得到了维吾尔族异常黑胆质结肠癌肠患者肠道菌群结构特征的DNA指纹图谱,从指纹图谱上选择一些特异性条带切下来回收,测序,测序出来的序列在基因库进行比对做出进化树了解菌群之间的亲缘性。结论异常黑胆质结肠癌患者肠道菌群基因序列的亲缘性结果显示肠道菌群的多样性明显少其中肠道优势菌比例低。     

贝赫切特综合征患者肠道菌群微生物宏基因组学分析

目的采用宏基因组学分析贝赫切特综合征(BD)患者肠道菌群微生物特征。方法选取2016年1月至2018年1月的BD患者18例,另选取性别、年龄、BMI相匹配的健康人群24例作为对照,收集BD患者与健康人群新鲜粪便提取DNA,进行宏基因组测序及生物信息学分析。结果BD患者与正常人优势菌群主要是硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。BD患者中Bacteroidetes占4.21%,远低于正常人,BD患者中Proteobacteria占42.80%,远高于正常人;BD患者与正常人胃肠道微生物在属水平上有194个菌属存在差异,在种水平上有887个菌种存在差异;BD患者优势菌包括Collinsella Spp.、Bilophila spp.及Bacteroides spp.等,正常人优势菌包括Clostridium spp.Roseburia spp.Methanogens等。结论BD患者肠道菌群微生物群发生改变,产乳酸菌Collinsella Spp.和硫酸盐还原菌Bilophila spp.增多,产丁酸菌Clostridium spp.和Roseburia spp.减少,可能为引起BD发病的机制之一。     

心境稳定剂影响双相情感障碍躁狂发作患者 肠道菌群变化

目的：探讨心境稳定剂是否通过影响肠道菌群改善双相情感障碍（BD）躁狂发作患者症状。方法：利用杨氏躁狂量表（YMRS）评估42例BD患者治疗前、后的临床症状，并采集粪便样本提取基因组DNA。经PCR扩增、文库构建和质检后，利用16S r DNA高通量测序和Uparse软件聚类筛选获得OTUs；利用QIIME软件计算肠道菌群α多样性的指数（Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数）；使用基于OTUs的Bray-Curtis距离进行PCoA分析，计算肠道菌群β多样性；利用LEfSe软件应用线性判别分析方法（LDA）进行差异物种筛选；ELISA检测BD患者治疗前、后血清IL-1β和TNF-α含量。结果：治疗前BD组的Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数低于HC组（P<0.05），治疗后BD组的Chao1指数和Observed species指数高于治疗前（P<0.05）；治疗前BD组的厚壁菌门及其下的梭菌纲、梭菌目、瘤胃球菌科、韦荣菌科、变形菌门和放线菌门丰度高于HC组，而治...     

基于高通量测序分析孤独症谱系障碍儿童肠道菌群的构成变化

目的 探讨孤独症谱系障碍(ASD)儿童肠道菌群的变化.方法 收集35例ASD患儿(ASD组)和35名体检健康儿童(正常对照组)粪便样本,提取基因组DNA,用Illumina测序平台进行测序分析,确定群体的肠道菌群特征.结果 ASD组与正常对照组的肠道菌群结构存在差异.在门水平上,ASD组与正常对照组优势菌门厚壁菌门、拟...     

脓毒症患者肠道菌群多样性和结构变化分析北大核心CSCD

目的探讨脓毒症患者发病过程中肠道菌群多样性和结构变化情况。方法对2015年11月至2016年3月期间于北京市多家三甲医院急诊科就诊并符合Sepsis3.0诊断标准的脓毒症患者25例和同时期30例非脓毒症患者的粪便样本进行检测,利用16S rRNA(16S ribosomal RNA)测序技术对肠道菌群进行测序,使用Uparse、Qiime、R及LEfSe软件等分析菌群多样性及其结构变化。结果脓毒症组和非脓毒症组患者在性别、年龄以及慢性基础疾病方面比较差异无统计学意义。两组在肠道菌群多样性方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组在肠道菌群结构方面比较,差异有统计学意义(P<0.05),即脓毒症组患者肠道菌群中Negativicutes纲、Selenomonadales目、Veillonellaceae科、Lachnospiraceae科、Faecalibacterium属、Hafnia属、Lachnoclostridium属、Blautia属及Ruminococcus种的菌群丰度明显降低;而Bacilli纲、Coriobacteriia纲、Lactobacillales目、Coriobacteriales目、Clostridiaceae科、Coriobacteriaceae科、Clostridium_sensu_stricto属、Collinsella属及Collinsella_aerofaciens种的菌群丰度明显增加。结论脓毒症组与非脓毒症组患者相比较,肠道菌群多样性无改变;而脓毒症组的患者存在肠道菌群组成结构改变。     

细菌性阴道病患者宫颈及阴道菌群多样性的比较与分析

目的比较与分析细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)患者宫颈及阴道菌群多样性的差异,探讨BV的病因及BV对不同解剖部位微生态的影响。方法采集BV患者阴道及宫颈分泌物标本,进行革兰染色及Nugent评分;并提取细菌总DNA,用通用引物对细菌16S r DNA的V3区进行扩增,将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)。对DNA指纹图谱特征条带切胶回收并进行克隆测序,用Gen Bank中的BLAST与已知序列比对,鉴定细菌菌种,对比分析不同生理状态下阴道及宫颈菌群的多样性。结果健康女性宫颈及阴道菌群多样性基本一致,其中乳杆菌属为优势菌,常见菌种为Lactobacillus crispatus、L.iners和L.gasseri。BV女性下生殖道菌群多样性较健康女性明显复杂,优势菌为Sneathia spp.、Atopobium vaginae及Gardnerella vaginalis等厌氧菌。BV女性宫颈菌群与阴道菌群有明显的差异,阴道菌群多样性较宫颈菌群丰富。结论健康女性下生殖道常见优势菌种为乳杆菌属;BV女性常见优势菌种则为Sneathia spp.、Atopobium vaginae及Gardnerella vaginalis等厌氧菌。女性下生殖道不同解剖部位的菌群存在差异,宫颈菌群多样性可随着阴道感染而发生改变。阴道微生态紊乱导致BV,有害菌可上行迁移而影响宫颈微生态。     

肠易激综合征各亚型与肠道菌群关系的初步研究

目的筛选研究肠道菌群的最佳标本类型,初步分析肠易激综合征(IBS)患者各亚型肠道菌群多样性变化及特异性菌群结构。方法根据罗马Ⅲ诊断标准,严格选择腹泻型IBS(IBS-D)患者51例,便秘型IBS(IBS-C)患者29例,混合型IBS(IBS-A)患者22例,以及健康对照者(对照组)40例;选择肠腔内液、组织、粪便作为标本进行优越性筛选;提取基因组DNA,巢式聚合酶链反应扩增细菌16srDNA及V1～V3区,采用变性梯度凝胶电泳等技术分析菌群多样性。结果同一患者不同标本中菌群多样性和结构组成比较显示,肠腔内液和组织标本相似,粪便标本与其他两种标本有明显差异;与对照组比较,IBS患者组菌群多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)明显降低,差异有统计学意义(P0.05);测序结果共鉴定出10条序列,于美国国家生物技术信息中心数据库blast后显示为:Bacteroides、Lachnospira、Enterobacter、Lactobacillus、Butyrivibrio、Enterococcus、Pseudobutyrivibrio、Bifidobacterium、Dorea、Tender fusobacterium,其中Enterobacter在所有IBS亚型中均明显增高(P0.01);Bacteroides主要在IBS-A患者肠道定植增多(P0.05);Lactobacillus和Bifidobacterium在IBS-D、IBS-C患者肠道定植明显多于对照组(P0.01);Enterococcus只在IBS-A患者肠道定植增多(P0.01);Tender fusobacterium只在IBS-D患者中减少(P0.05);Dorea在IBS-D和IBS-A患者中出现频率增高(P0.01)。结论肠腔内液标本可代替组织标本研究IBS患者肠道定植菌群结构和组成;IBS患者肠道菌群多样性明显降低,且各亚型肠道菌群组成和数量也有明显差异。     

MLPA及测序技术在DMD/BMD家系分析中的应用

目的运用MLPA技术和DNA及cDNA测序技术对DMD/BMD进行家系分析,对患者、可能携带者基因诊断并探讨诊断流程的临床可行性。方法对2个DMD/BMD家系中6例患者、13例女性可能携带者、6例男性家系成员,6例女性和男性健康对照共31例采集外周血提取DNA,运用MLPA技术分析对以上31例的DMD基因79个外显子;患者取右侧腓肠肌10～30mg肌肉提取RNA,逆转录cDNA;分别进行DNA及cDNA序列测定,测序结果与MLPA结果进行比较。结果经MLPA检测,家系1的4例患者均缺失DMD基因Exon50,家系2中2例患者均缺失Exon43。以上结果经肌肉cDNA测序证实了相应外显子缺失。结论 MLPA技术结合DNA及cDNA测序技术进行DMD家系分析具有可靠的临床应用价值。     

患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群分析

目的探讨患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群的变化特征。方法以21例患2型糖尿病的肥胖者作为研究组,21名血糖正常的肥胖志愿者作为对照组。取研究组和对照组新鲜粪便,采用Illumina Miseq高通量测序平台对粪便样本中所有细菌的16S r RNA-V3区进行DNA测序,分析肠道菌群物种的丰度和分布,并进行聚类分析。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)对肠道菌群进行定量分析。结果成功进行了DNA测序分析,样本稀疏曲线显示测序深度充分,测序覆盖深度(Coverage指数)0.99。研究组肠道菌群2个丰度指数(Ace和Chao1)均低于对照组(P0.05),2个多样性指数(Shannon和Simpson)分别低于和高于对照组(P0.05)。实时定量PCR结果显示,在门水平,研究组的厚壁菌门和放线菌门均低于对照组(P0.05),而拟杆菌门高于对照组(P0.05),其他2个菌门(变形杆菌门和梭形杆菌门)差异无统计学意义(P0.05);在属水平,研究组的韦荣球菌属、Ⅳ型梭菌属和拟杆菌属均高于对照组(P0.05),而乳杆菌属、Blautia球菌-直肠真杆菌属、普雷沃菌属和双歧杆菌属均低于对照组(P0.05)。结论患2型糖尿病的肥胖人群肠道菌群的丰度和多样性下降,定量分析肠道菌群的构成对该人群有特殊意义。     

Detection of Klebsiella pneumonia in respiratory tract samples by the loop-mediated isothermal amplification method

目的:建立环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测呼吸道感染患者痰液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)的方法并进行初步应用。方法:基于Kpn phoE基因设计4条特异性引物,对反应条件中的Mg^2+和甜菜碱浓度进行优化,建立检测Kpn LAMP方法并进行特异性和灵敏度试验;收集308例呼吸道感染患者痰液样本,进行细菌培养法、LAMP法、DNA测序技术检测,评估LAMP检测体系。结果:8 mmol/L、0.4 mmol/L确定为Mg^2+和甜菜碱的最佳扩增浓度;该体系特异性强,与其他菌株无交叉反应,灵敏度为104 CFU/mL;临床样本中Kpn的LAMP检出率(53.89%)高于培养法(42.20%),差异有统计学意义(χ^2=161.65,P<0.05);LAMP法与细菌培养法在Kpn阳性样本、无细菌生长样本、非Kpn其他细菌阳性样本中的一致率分别为96.15%、100%、65.25%,46例不一致样本经DNA测序验证,LAMP法与测序符合率为86.95%(40/46);LAMP法和DNA测序法对131例样本同时进行检测,经Kappa检验两者具有极好的一致性(Kappa系数=0.817)。结论:与细菌培养法相比,LAMP法具有准确性高、灵敏度高、特异性强、反应省时等优势,可以作为肺炎克雷伯菌的快速检测方法。     

DNA微阵列技术在CYP2C19基因多态性检测中的应用

目的探讨DNA微阵列技术检测CYP2C19基因多态性的应用价值。方法用PCR结合DNA微列阵技术检测300例精神疾病患者的CYP2C19基因型,并用DNA测序法验证DNA微列阵技术检测结果的可靠性。结果 CYP2C19基因型检测结果分别为快代谢型109例(36.3%),中等代谢型158例(52.7%),慢代谢型33例(11.0%);DAN微阵列技术检测结果与DNA测序法结果完全一致;患者性别之间基因型和表型所占比例差异均无统计学意义(P均0.05)。结论 DNA微阵列技术检测CYP2C19基因多态性具有快速、准确的特点,可替代DNA测序法用于个体化医疗。     

PCR反向点杂交技术与DNA测序法检测HPV的对比研究

目的通过PCR反向点杂交技术检测人乳头瘤病毒(HPV),并采用DNA测序法对此方法进行验证,比较两种检测方法的一致性,为临床使用PCR反向点杂交技术进行HPV DNA检测提供准确依据。方法采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法对喀什地区第一人民医院妇科门诊收集的27例HPV感染患者进行检测,将两种检测方法得到的检测结果进行比对。结果采用PCR反向点杂交技术和DNA测序法得到的检测结果一致,27例样本中阳性检出率100.0%,其中高危型检出率为85.2%,低危型检出率为14.8%,多重型别感染率为25.9%。结论两种HPV检测方法的结果符合率100.0%,PCR-反向点杂交技术检测结果准确度高,可以为临床诊断提供准确可靠的依据。     

双歧三联活菌治疗肝硬化患者的疗效及对肠道菌群的影响

目的探讨双歧三联活菌治疗肝硬化患者的疗效及对肠道菌群的影响。方法选取116例肝硬化患者为研究对象,将采取常规综合治疗的患者设为对照组(n=58),加用双歧三联活菌治疗者设为研究组(n=58),观察2组患者肝硬化疗效、肠道菌群变化。结果研究组患者肝硬化整体有效率显著高于对照组(P 0. 05);治疗后,研究组需氧菌、厌氧菌水平均显著高于对照组,酵母样真菌水平显著低于对照组(P 0. 05)。结论双歧三联活菌可优化肝硬化患者的治疗效果,纠正肠道菌群紊乱。     

DA8600测序平台对EGFR基因检测最低DNA用量的探讨

目的 基于DA8600测序平台,探讨AmpliSeq建库方法检测EGFR基因突变所需最低样本DNA用量,以评估下一代测序(next generation sequencing,NGS)检测技术的性能. 方法 本研究选择10例EGFR突变的石蜡包埋组织样本,分别取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng样本DNA进行文库构建,使用DA8600半导体测序仪进行检测,并比较检测结果. 结果 10 ng和20 ng DNA用量均可全部准确检出EGFR基因突变;5 ng DNA用量准确检出7例EGFR基因突变,1例文库质量不合格无法进行测序,1例无法检出EGFR突变,1例测序数据量不足检测失败;1 ng DNA用量构建文库全部质量不合格,无法进行测序. 结论 通过对10例样本不同DNA用量构建文库的检测结果分析,说明10 ng DNA即可采用AmpliSeq建库方法在DA8600半导体测序仪进行EGFR基因突变检测.     

高分辨率熔解曲线分析在血友病B F9基因突变检测中的应用

目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立简便有效的血友病B(HB)基因诊断的方法.方法 收集2005年1月至2010年6月就诊于上海瑞金医院的55例HB患者的外周血标本,抽提外周血基因组DNA.采用PCR扩增结合测序的方法对40例HB患者进行F9基因突变检测,利用其中21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本建立相应的HRM突变筛查方法.采用F9基因1～7号外显子的PCR-HRM突变筛查方法及8号外显子的DNA直接测序方法,对15例未知F9基因突变的HB患者进行基因诊断.结果 通过PCR扩增结合测序,40例HB患者均检测到F9基因突变.21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本中,19例(90％)患者的突变可通过PCR-HRM技术进行检测.通过F9基因1～7号外显子PCR-HRM突变筛查及8号外显子的DNA直接测序,15例未知F9基因突变的HB患者均检测到F9基因突变.55例HB患者中共检测到34种F9基因突变.结论 HB基因诊断的新方法,即PCR-HRM筛查F9基因1～7号外显子突变结合8号外显子的DNA测序法操作简便、结果可靠.     

急性胰腺炎患者肠道微生态及其与病情严重程度的相关性: 一项前瞻性横断面研究

  目的  探究急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)患者肠道菌群变化特征及其与病情严重程度的相关性。  方法  本研究为前瞻性横断面研究。研究对象为2018年6月至2022年1月北京协和医院AP患者和健康志愿者。收集两组临床资料及粪便标本,对其肠道菌群16S rRNA进行DNA测序并进行生物信息学分析。比较两组肠道菌群差异,并采用受试者操作特征曲线分析肠道菌群与AP病情严重程度的相关性。  结果  共入选符合纳入和排除标准的AP患者60例、健康志愿者20名。AP患者中,轻症、中度重症、重症患者各20例,住院期间转入ICU 22例,未转入ICU 38例。α多样性分析显示,AP患者肠道菌群Shannon指数低于健康志愿者(P＜0.05);β多样性分析显示,AP患者肠道菌群结构异于健康志愿者。在门、科、属、种水平的比较中,AP患者与健康志愿者肠道菌群分布均存在差异。线性判别分析结果显示,包括大肠志贺菌属、肠球菌属和肠球菌科在内的多个菌群在AP患者中呈优势分布,而布劳特氏菌属和双歧杆菌属等菌群在健康志愿者中呈优势分布。功能分析提示AP患者肠道菌群中多种氨基酸合成受阻,菌群致病性与迁移能力增强。ICU患者与非ICU患者的亚组分析亦可观察到类似变化,ICU患者肠球菌表达增多,拟杆菌表达降低。受试者操作特征曲线显示,基于表达差异菌种计算的疾病概率(probability of disease, POD)指数识别AP患者、转入ICU的AP患者的曲线下面积分别为0.996、0.743。  结论  AP患者肠道致病性菌群增多、有益菌减少。肠道菌群变化与AP病情严重程度相关,有望作为AP的新型生物标志物。     

高通量测序分析牙周基础治疗对65岁以上糖尿病合并慢性牙周炎患者龈下菌群的影响

目的:采用高通量测序技术分析牙周基础治疗对65岁以上糖尿病合并慢性牙周炎(diabetes mellitus with chronic periodontitis,DMCP)患者龈下菌群的影响。方法:选取100例65岁以上DMCP患者作为研究对象,采用随机数据表法将患者分为研究组与对照组,每组50例。对照组给予强化控制血糖、基础疾病对症治疗、口腔卫生知识宣教等常规治疗,研究组在此基础上给予牙周基础治疗,治疗及复诊在4周内完成。比较2组患者的基线资料,采用高通量测序技术比较2组患者治疗前、治疗后3个月时牙周龈下菌群中致病菌的相对含量。结果:研究组与对照组分别有2例和5例患者失访,最终分别纳入48例和45例患者。2组患者各项基线资料的差异均无统计学意义(均P>0.05)。2组患者治疗前牙周龈下菌群中各类病原菌相对含量及牙周龈沟液中各种氧化还原物质水平的差异无统计学意义(P>0.05)。在治疗后3个月时,2组患者牙周龈下菌群中各类病原菌相对含量均较治疗前下降,差异均有统计学意义(P>0.05),研究组牙周龈下菌群中各类病原菌相对含量均低于对照组,差异均有统计学意义(P>0.05)。结论:牙周基础治疗能够显著减少DMCP患者牙周龈下菌群中致病菌的含量,纠正口腔菌群失调。     

广东地区非小细胞肺癌EGFR基因的突变研究

目的 探讨广东地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者中EGFR基因的突变情况.方法 用微分离富集肿瘤细胞,采用QIAGEN DNA提取试剂盒提取基因组DNA,通过PCR扩增及DNA测序技术分析非小细胞肺癌患者中EGFR基因突变情况.结果 43例非小细胞肺癌中,有22例(51.2%)存在EGFR基因的突变,其中13例为外显子...     

重症监护室肺部感染患者肠道菌群特征分析

目的 探究重症监护室(ICU)肺部感染患者的肠道菌群特征,为肺部感染的危重症患者微生态靶向治疗提供借鉴。方法 收集2021年3-9月入住重庆高新区人民医院ICU的肺部感染患者粪便样本78例,ICU非肺部感染患者粪便样本22例,健康人群的粪便样本40例,采用16S rRNA测序技术对粪便菌群进行检测鉴定,通过生物信息学方法比较并分析ICU肺部感染患者肠道菌群结构特征。结果 ICU肺部感染患者的肠道微生物与健康人群相比,alpha多样性显著降低。ICU肺部感染患者肠道菌群以厚壁菌门、拟杆菌门、普雷沃菌属和拟杆菌属为主。处于极度失调(单一菌群丰度>50%)的ICU肺部感染患者的肠道菌群主要富集了普雷沃菌属、拟杆菌属、肠球菌和埃希菌等细菌。LEfSe分析提示,疣微菌科是ICU肺部感染患者肠道菌群中的标志性微生物。ICU肺部感染患者与健康人群相比,糖类和氨基酸代谢通路有所降低。另外,患者年龄结构、体质量指数、急性生理与慢性健康评分系统Ⅱ评分和住院时间与部分肠道菌群存在紧密联系。结论 ICU肺部感染患者与健康人群相比,肠道菌群多样性显著降低。ICU肺部感染患者中肠道菌群极度失调者,可能由于感...