1株9型猪链球菌全基因组分析北大核心CSCD

目的探索9型猪链球菌基因组功能及遗传关系。方法采用生物信息学方法对1株9型猪链球菌强毒株GD18的全基因组序列进行注释,并与GenBank上的15株猪链球菌进行比较基因组学分析。结果GD18菌株基因组全长2067661 bp,总蛋白1961个,注释到COG、GO、KEGG、CAZy和PHl-base数据库的基因分别占总蛋白的77.05%、71.29%、43.91%、4.49%和3.37%。毒力因子分析表明猪链球菌毒力因子的复杂以及并非所有的猪链球菌菌株都有一套通用的毒力因子。耐药基因分析表明GD18含多种类的耐药基因,且存在丰富的外排系统。蛋白预测结果显示GD18具有114个信号肽蛋白和30个分泌蛋白。16个菌株基因组比较分析发现共有的核心基因为1244个,非共有基因共1685个,特有基因共1417个。进化分析表明GD18与加拿大分离株89-3576-3亲缘关系最近,且国内菌株基本处在不同分支。结论对1株9型猪链球菌分离株的全基因组、基因功能、进化关系等进行分析,为9型猪链球菌基因组整体水平的研究奠定基础和提供数据支撑。     

福建省2005-2008年临床乙脑病毒分离株的序列分析

目的分析2005-2008年福建乙脑病毒毒株的部分基因组序列,探索乙脑病毒临床分离株的变异和进化。方法临床标本(血清或脑脊液)接种BHK-21细胞,分离乙脑病毒,从培养液上清提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒基因组片段,并进行克隆、测序以及序列分析。结果共分离到5株乙脑病毒。对病毒C/prM区240bp和全长E基因的序列分析表明,近几年的这些临床分离株基因型仍然全部属于G3型。种系发生分析结果显示,新分离株与2002、2003年分离株存在较大同源性。虽然病毒E基因存在少量氨基酸改变,但总体上这些变异不足以影响病毒的致病性。结论近几年福建省的临床乙脑病毒分离株为G3型,新分离株亲缘关系比较接近2002、2003年毒株。     

DG01株H5N1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIV H5N1亚型全基因组序列设计了8对引物,对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A/Duck/Guangdong/DG01/05(简称DG01)毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22 341bp,PB1 2 341bp,PA2 233bp,HA1 779bp,NP 1 565bp,NA1 398 bp,M1 027bp,NS 875 bp 8个节段组成,与往年及同年一些流行株比较分析结果显示,DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征,NA基因及NS1基因均有部分缺失,从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查

目的了解我国不同地区表观健康猪群携带猪链球菌的情况。方法从我国20个不同地区屠宰场采集248份扁桃体,进行增菌培养后用PCR方法进行猪链球菌种型鉴定并用血清凝集试验复检,最后用多位点序列分型(Multilocus se-quence typing,MLST)系统研究各菌株之间的遗传关系。结果从248份扁桃体中共检出14株猪链球菌(检出率为5.65%),其中3株为猪链球菌2型,2株为猪链球菌7型,1株为猪链球菌9型,8株未定血清型;对6株定型菌株进行毒力因子(mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh)检测发现5种毒力基因型:A1Cps2+mrp-epf+sly+orf2+fbps+gapdh+、A2Cps2+mrp-epf+sly-orf2-fbps+gapdh-、A3Cps7+mrp+epf-sly-orf2-fbps-gapdh+、A4Cps9+mrp-epf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5Cps7+mrp-epf-sly-orf2+fbps+gapdh+,A1和A2型的分离株为弱毒株,其他型菌株的毒力无法确定;经MLST分析,3株猪链球菌2型属于ST1,1株猪链球菌7型属于ST29,1株猪链球菌9型(CQ15)属于一个国际上未报道过的新ST型,该型被猪链球菌MLST数据库(http://ssuis.mlst.net)收录并编号为ST128。结论不同地区表观健康猪群平均带菌率为5.65%,分离到的猪链球菌2型均为弱毒株。     

噬菌体Chy5的生物学和基因组学特征

目的 筛选能感染结核分枝杆菌的溶源性噬菌体,了解其生物学及遗传学信息。方法 从土壤中分离纯化噬菌体;电镜观察噬菌体形态;单斑法测定宿主谱;提取噬菌体DNA,鸟枪法随机测序。采用DNAStar软件包分析基因组成分,Glimmer3.0、GeneMark软件预测基因功能,同时做共线性分析。分离溶源菌,通过紫外线诱导试验、超免反应验证噬菌体溶源性。结果 分离到一株新的噬菌体Chy5,其头部直径(61.5±1.4) nm,尾部长度(114.1±2.1) nm,为长尾噬菌体,可感染敏感及耐药结核菌株。Chy5基因组全长51 214 bp,G+C含量63.60%,与噬菌体D29基因组最相似,有88个推定基因,含有编码整合酶和阻遏蛋白的基因以及attP位点。经紫外线诱导Chy5溶源菌可形成噬菌斑,Chy5与其溶源菌共培养会发生超免反应。结论 分离到一株新的能感染敏感及耐药结核菌的溶源性噬菌体Chy5,其基因组与噬菌体D29相似,有望应用于构建荧光报告噬菌体。     

DG01株HSN1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIVH5N1亚型全基因组序列设计了8对引物，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A／Duck／Guangdong／DG01／05（简称DG01）毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22341bp，PB1 2341bp，PA2 233bp，HA1 779bp。NP1 565bp，NA1 398bp，M1 027bp。NS 875bp8个节段组成，与往年及同年一些流行株比较分析结果显示。DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征，NA基因及NS1基因均有部分缺失，从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

手足口病患儿感染肠道病毒71型全基因组基因特征分析

目的从手足口病患儿粪便中分离肠道病毒71型(EV71),对其进行全基因组测序,了解秦皇岛市EV71全基因组基因特征,为手足口病的综合防治提供依据。方法从秦皇岛市各医院收集手足口病患儿粪便标本,进行EV71检测,阳性标本进行病毒分离及核酸提取,通过RT-PCR进行全基因组序列扩增,通过电泳、测序及序列拼接一系列操作分析其基因特征。结果用提取的核酸扩增出7 406bp的目的基因片段测序后与已记录的EV71相应序列进行比对完全一致,且测序峰图较好,可信度也较高;各基因片段间通过核苷酸序列拼接后得出,秦皇岛市医院EV71全基因组序列长7 406bp,编码区各基因片段的长度分别为:2A450bp、2B297bp、2C987bp、3A258bp、3B66bp、3C549bp、3D1 386bp、VPl 891bp、VP2 762bp、VP3 726bp、VP4 207bp。结论秦皇岛市EV71分离株为C4a型全基因组序列长7 406bp,可为当地手足口病的防控提供参考。     

O157∶H7原噬菌体消除菌株的鉴定与分析

目的　O15 7∶H7是一种重要的新发传染病病原 ,它主要引起出血性或非出血性腹泻 ,出血性结肠炎 (HC)或溶血性尿路综合征 (HUS)等。研究表明引起HC和HUS的主要毒力因子是由整合到O15 7基因组中的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx) ,包括Stx1和Stx2 ,它们分别由原噬菌体 933v和 933w所编码。由于原噬菌体本身具有潜在的不稳定性 ,本研究以O15 7∶H786 - 2 4为始发菌株 ,将其进行传代培养 ,筛选原噬菌体消除菌株 ,对原噬菌体在O15 7基因组中的整合位点进行分析 ,并用Vero细胞对原噬菌体消除菌株的细胞毒性进行鉴定。结果筛选到了原噬菌体消除后的O15 7菌株 ,该菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用。序列比较分析表明原噬菌体 933v的整合位点位于O15 7∶H7EDL933基因组中第 2 96 6 137位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 2 0bp的直接重复序列 ,原噬菌体 933w的整合位点位于基因组中第 1330 82 6位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 7bp的直接重复序列。该研究证实了编码Stx的原噬菌体具有不稳定性 ,原噬菌体对O15 7的致病性具有重要作用 ,也提示原噬菌体在致病菌的进化过程中也具有重要作用。     

猪链球菌2型转录调控因子Rex原核表达及体外结合活性分析

目的克隆猪链球菌2型转录调控因子Rex的编码基因进行原核表达和纯化,对其进行生物信息学分析和体外结合活性测定。方法 PCR扩增猪链球菌2型强毒株SS2-1的Rex基因编码区,将其克隆入pET28a质粒中,再将pET28aRex重组质粒转入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后能表达出猪链球菌Rex蛋白;通过体外凝胶迁移实验(EMSA)对Rex蛋白与DNA的结合活性进行分析。结果成功地原核表达并纯化了Rex重组蛋白。Rex蛋白与自身启动子Prex特异性结合,高浓度的NADH抑制两者的结合活性,而NAD~+对结合没有影响。结论通过体外结合试验发现Rex是通过响应NADH/NAD~+平衡来调控自身基因的表达。     

2型猪链球菌人源致病株07NJH06的分离和病原生物学鉴定

目的系统分析鉴定南京地区脑膜炎型猪链球菌感染病人脑脊液分离株07NJH06病原生物学特性。方法采集患者脑脊液,进行细菌分离和培养,观察菌体显微形态,通过免疫凝集试验和PCR方法对分离物进行种属鉴定及毒力因子基因携带情况分析,纸片法测定菌株药物敏感性,采用小白鼠和仔猪模型评估分离菌株的致病特性。结果从病人脑脊液分离到1株革兰阳性链球菌,经免疫学、生物化学及分子生物学方法系统鉴定为2型猪链球菌（命名为07NJH06）,毒力基因型为cps2J＋mrp＋epf＋sly＋gdh＋fbp＋srtA＋,未获得含有完整毒力岛PAI89k的证据,该岛两侧边缘反向重复区靶基因以及岛内二元调控系统SalK/SalR均未检出,但针对岛内3个独立的镶嵌结构区代表基因进行扩增,其中2个结构区代表基因（05SSU0942和05SSU0965）得到特异性扩增;药敏试验显示,07NJH06株对青霉素、万古霉素等抗生素敏感,对四环素、头孢噻肟钠等抗生素耐药;动物感染试验显示,07NJH06株对小鼠和猪仔有致病性,毒力较国内暴发流行强致病株05ZYH33弱,与国际参考株毒力相当。结论07NJH06株为致病性2型猪链球菌,基本生物学特性、主要毒力基因型与既往国内暴发现场分离株相似,但不含有完整的毒力岛PAI89k基因结构,系统掌握该菌遗传信息对于阐明国内强毒株遗传进化规律有重要价值。     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。     

中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析

目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD-11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT-PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列。结果两株病毒全长均为10 707nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0%,氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近。结论 GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原。     

宁波地区海产品及环境中副溶血弧菌主要毒力及耐药性分析

目的了解浙江省宁波地区海产品和环境中副溶血弧菌主要毒力和耐药性。方法采用生化反应、抗菌药物敏感性试验及PCR方法对分离的宁波地方副溶血弧菌进行毒力及耐药性测定。结果 90株分离株中,耐热直接溶血素基因（tdh）阳性率为2.2%,与神奈川溶血表型（KP,Kanagawa phenomenon）一致,但在tdh＋和KP阳性的分离株中未检测到Ⅲ型分泌系统2（T3SS2）;trh与ureC基因携带率分别为20.0%和12.2%,而在11株trh＋-ureC＋菌株中未显示尿素酶表型阳性,2株尿素酶阳性的菌株未携trh或ureC基因;Ⅵ型分泌系统的携带率为17.8%。所有的分离株对氟喹诺酮类、氯霉素类、四环素类药物敏感;72%以上分离株对青霉素类、磺胺类及氨基糖苷类中链霉素和卡那霉素耐药;分离株中至少耐2种药物,最多耐10种药物,超过82%的分离株对6种以上药物耐药。耐药基因tetB的检出率为0,bla TEM、sul2和strB的携带率分别为91.7%、16.7%和43.3%。结论宁波地区相当比例的菌株携带毒力,并呈现不同程度耐药。     

2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立

目的建立针对高致病性2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。方法根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统(T4SS-89K)的virB4-89K基因保守区域设计并合成LAMP引物,通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法,对方法的特异性、敏感性进行评估。结果优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率,检测灵敏度为1.53×101拷贝/反应,全部扩增检测可在60min内完成;建立的LAMP法具有良好的特异性,与不含T4SS-89K的猪链球菌(包括1/2型、1型、3~33型),以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增,而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增。结论建立的LAMP方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,可用于高致病性SS2快速检测。     

Virulence of Malaysian isolates of Orientia tsutsugamushi in mice

The pathogenicity of Malaysian isolates of Orientia tsutsugamushi was investigated by a mouse virulence assay. The isolates could be differentiated as low (4 isolates), moderately (3 isolates) and highly virulent (2 isolates) based on the different responses in infected mice. No direct correlation between severity of human scrub typhus infections and virulence of the O. tsutsugamushi in mice was observed. Mice infected with virulent strains of O. tsutsugamushi showed splenomegaly, ascitis accumulation and enlargement of kidneys and livers whereas avirulent O. tsutsugamushi strains were asymptomatic and exhibited ruffled fur for a short period after infection. There was low antibody response in mice infected with isolates of low pathogenicity as compared with those of highly virulent isolates. Upon dissection of the infected mice, enlargement of mouse organs such as spleen, kidney and liver was noted. Presence of rickettsemia in mice was confirmed by the growth of O. tsutsugamushi in the L929 cells when inoculated with blood from infected mice. O. tsutsugamushi was also cultured from the peritoneal exudates of the infected mice. However, DNA of O. tsutsugamushi was only detected in the peritoneal exudates (by PCR) and blood (by cell culture) and not from other tissue samples.     

猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析

目的为了解福建地区猪链球菌2型菌株毒力因子分布情况。方法选取谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列orf2等7个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计了7对引物,采用PCR方法,对本室分离保存的猪链球菌2型福建分离株的毒力基因进行分析。结果从屠宰生猪体内分离的4个猪链球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fb-ps+/orf2+,另1株从生猪体内分离的分离菌株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。结论福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。     

5-HT4受体对人消化间期小肠运动调控及其机制研究

目的通过观察5-羟色胺(5-HT4)受体激动剂对人消化间期移行性复合运动(MMC)及血浆胃肠激素的影响,探讨5-HT4受体激动剂对MMC的调控作用及其可能的介导因素。方法选取健康志愿者18人并观察给予选择性5-HT4受体激动剂后MMC的变化。并且在给药前后检测MMC不同时期血浆胃动素(MOT)、生长抑素(SS)、NO的浓度。结果健康人给药后MMC周期显著缩短[(87.5+24.2)min vs(60.5±18.4)min,P0.001],MMCⅢ期波幅、动力指数、传播速度均比给药前显著升高(P0.05)。MMC不同时期血浆MOT含量无显著变化(P0.05),SS水平显著升高(P0.01),而NO含量显著降低(P0.05)。结论 5-HT4受体激活对人MMC有兴奋性作用,该兴奋作用可能通过SS、NO等胃肠激素起作用。     

猪源肠出血性大肠杆菌的分离、鉴定及特性研究

目的探讨猪源肠出血性大肠埃希菌病原学特征。方法对所分离的菌株进行生化鉴定、药敏试验,并使用聚合酶链反应(PCR)技术检测毒力基因、耐药基因,同时对致病性的菌株进行外膜蛋白分型、REP-PCR和ERIC-PCR分析。结果从315株大肠杆菌中筛选到山梨醇阴性的EHEC21株,其中含有stx1基因的菌株有4株,含有stx2基因3株,含有eae基因的17株,外膜蛋白分型属于三个型,其中OMP-1型最多,有15株,OMP-2型3株,OMP-3型3株,REP-PCR和ERIC-PCR结果显示这些致病性菌株带型差异性较大,分属于不同的亚群。结论华中地区是养殖业比较发达的地区,而且人均消费猪肉比例也较高,EHEC的存在对人是一种潜在的威胁,应加强监测力度,防止该菌在人群中感染和流行。     

耐红霉素肺炎链球菌的分子生物学研究

目的研究耐红霉素肺炎链球菌的分子生物学特点。方法社区获得性肺炎呼吸道标本分离的肺炎链球菌共45株,进行抗生素药物敏感性试验,对耐药菌株采用PCR方法检测红霉素的耐药基因ermA/ermB/mefA,同时采用脉冲场凝胶电泳技术和青霉素结合蛋白基因多态性追踪耐药菌株之间的同源性,以获得耐药菌株的分子流行病学特点。结果45株肺炎链球菌中对红霉素耐药24株,均为多耐药肺炎链球菌;青霉素耐药14株,其中11株（78.6%）同时耐红霉素。22株（92%）的红霉素耐药株为MLS表型,即同时耐克林霉素,2株为M型耐药。经PCR扩增,20株（83.3%）具有ermA/B基因,6株（25.0%）同时有erm和mef基因,2株（8.3%）只有mef基因,2株未能检测到erm或mef基因。脉冲场凝胶电泳和青霉素结合蛋白基因多态性检测未发现不同地区相同的耐药克隆株。结论erm基因编码的核糖体突变是肺炎链球菌耐红霉素的主要机制,本研究未发现不同地区相同的耐药克隆株。