基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A和B产生的β-半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β-半乳糖苷酶的活力。通过单因素试验和正交试验,选出了超声波破碎的最佳工艺条件。实验表明,嗜酸乳杆菌A在工作时间7.6min,工作/间歇为28s/20s,温度36℃时,超声波对细胞的破碎效果较好,此条件下破碎后,A株产生的β-半乳糖苷酶活力为5.963μmolONP/L·min。嗜酸乳杆菌B在工作时间6.8min,工作/间歇为20s/20s,温度37℃时效果较好,产生的β-半乳糖苷酶活力为6.683μmolONP/L·min。因此,嗜酸乳杆菌具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力。     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。     

黄芪对嗜酸乳杆菌生长及其产酶活的影响

研究添加不同浓度的黄芪提取液对嗜酸乳杆菌生长及产酶能力的影响,对比在改良的MRS培养基中添加与未添加黄芪提取液对嗜酸乳杆菌的生物量和生长周期的影响,同时测定了嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和淀粉酶的酶活,确定黄芪提取液的最佳添加浓度.结果表明:当添加黄芪提取液浓度为0.032mg/mL时对嗜酸乳杆菌生长有明显的促进作用,且在此浓度下pH达最低值3.88;当添加黄芪提取液浓度为0.016g/mL时,嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和淀粉酶的酶活达到最高值,分别为387.56、14.42、4.4U.     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的乳酸乳球菌表达

构建棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶食品级分泌表达载体并在乳酸乳球菌MG1363(L.lactis MG1363)中实现表达。通过PCR扩增L.lactis MG1363基因组中分泌信号肽Usp45、质粒pLEB590的乳链菌肽(Nisin)抗性基因NisI和质粒pPIC9k-Abgl的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因Abgl,PCR方法连接后获得片段Usp45-Abgl-NisI,将其克隆到质粒pMD19中,CaCl2法转化到E.coli DH5α,测序鉴定后将该片段连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e中并转化到E.coli XL1-Blue,得重组子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI。通过PCR方法敲除质粒pMG36e-Usp45-Abgl-NisI中红霉素抗性基因以构建食品级分泌载体pMG36N-Usp45-Abgl-NisI,将其电转到L.lactis MG1363中。转化子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI能将β-葡萄糖苷酶分泌到胞外使七叶苷平板显色,L.lactis MG1363/pMG36N-Usp45-Abgl-NisI能在20 IU/mL Nisin上生长,经RT-PCR验证β-葡萄糖苷酶在乳酸乳球菌中实现表达。表明分泌型表达载体构建成功,为其在乳酸乳球菌中实现食品级活性表达奠定基础。     

产耐热β-半乳糖苷酶蜜源芽孢杆菌的鉴定及酶学性质

从分离自蜂蜜的芽孢杆菌中筛选到一株高产β-半乳糖苷酶的菌株,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为Bacillus licheniformis SYBC hb15。纯化该酶并研究其酶学性质,以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,B. licheniformis SYBC hb15所产β-半乳糖苷酶的最适水解反应温度是60℃;70℃放置60 min后酶活力仍保留65%,具有较高的热稳定性;与嗜热菌Talaromyces thermophilus来源的β-半乳糖苷酶相比,葡萄糖对其水解活性的抑制较弱。因此,B. licheniformis SYBC hb15所产的β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性和葡萄糖耐受性,有很好的工业应用潜力。     

不同来源食品级乳酸菌及双歧杆菌对乳酸链球菌素敏感性的研究

目的:研究不同来源的食品级乳酸菌和双歧杆菌对乳酸链球菌素(nisin)的敏感性,为构建以nisin作为食品级筛选标记的受体乳酸菌表达系统以及筛选食品发酵、保鲜与贮藏过程中的nisin抗性乳酸菌提供科学依据.方法:采用试管稀释法研究不同来源的食品级的18株乳酸球菌、15株乳酸杆菌和5株双歧杆菌对nisin的敏感性.结果:大部分乳球菌和部分乳杆菌对nisin不敏感,但乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ML0230、99210,肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum)AS 1.2141T,嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La1,德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)S-1、DR、LD、AS 1.2625T,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)Blm对nisin非常敏感.在nisin质量浓度为5 μg/mL(IU/mL)时即可抑制其生长.结论:初步筛选出17株以nisin作为食品级筛选标记的受体乳酸菌,同时筛选出21株食品发酵、保鲜与贮藏过程中的nisin抗性乳酸菌.     

信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌

为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肤构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株.结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02 U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6％.该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考.     

植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究

以L. plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。     

几种乳酸菌S-层蛋白的普查以及slp基因的克隆与序列分析

从内蒙古传统发酵乳制品中分离的几种乳酸菌,包括干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧乳杆菌和嗜酸乳杆菌标准株(L.acidophilus ATCC4356)等为实验材料,应用SDS-PAGE方法和PCK方法分别进行S-层蛋白(S-layers pro-tein,SLP)的普查和slp基因的检测.结果表明:在各种乳酸茵中,经SDS-PAGE电泳方法检测,只有植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和其标准菌株的样品中出现膜外蛋白的可疑条带,大小为44～66ku之间,与文献报道的slp基因表达产物大小范围是一致;经PCR方法检测,只有嗜酸乳杆菌和其标准菌株L.acidoilus ATCC4356中扩增出slp基因可疑条带,其大小约为1 300 bp.并对嗜酸乳杆菌slp基因进行克隆、基因序列测序和分析.     

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH 值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对oNP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。     

具有优良发酵特性德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选及其益生特性

本研究对10株实验室保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种产酸能力,产黏能力,产香能力和贮藏期稳定性进行测定,并通过测定乳酸菌对抗生素的耐药性、抑菌能力、β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性、α-半乳糖苷酶(α-Gal)活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性探究菌株的益生特性。单菌株发酵实验结果表明:菌株KSDB-1凝乳时间短(6.3 h),凝乳酸度为76.02°T,具有较好的产酸能力,同时黏度和持水力分别为1305.67 mPa.s和50.55%,显著高于其他菌株(p0.05);菌株HDS-13、DDB14、KSDB-1具有较好的产香能力较好,其中菌株HDS-13的双乙酰含量为2.88mg/L,乙醛含量达到了30.08mg/L,可有效改善酸奶的风味。益生特性实验结果表明:10株供试菌株对大部分抗生素表现为敏感,具有较高的安全性;菌株HDS-13、DDB-14、HDB-1、HDS-18、KSDB-1对6株致病菌均具有一定的抑制能力,能有效抑制肠道致病菌的生长;菌株HDS-12和KSDB-1乳酸脱氢酶活力较高;菌株HDS-12,HDB-17β-半乳糖苷酶活力较高;菌株DDS-15α-半乳糖苷酶活力显著高于其他菌株(p0.05),达到了1.33U/mg。综合得出:菌株KSDB-1发酵特性良好,具有一定的益生特性,作为酸乳发酵剂具有潜在的工业应用前景。     

利用枯草芽孢衣壳蛋白表面展示β-半乳糖苷酶

分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的启动子和编码序列与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB进行重组,构建融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒。将4种重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(trp-),获得了能在芽孢表面展示的重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704。经Western blot检测,4种重组菌株均表达了预期分子量的融合蛋白,初步表明β-半乳糖苷酶被锚定在重组菌株的芽孢表面。以oNPG为底物测定4种重组菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力,得到的酶活分别为0.14、0.06、0.22和0.20 U/mL。     

不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响

在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵产转糖基β-半乳糖苷酶过程中,以单因素试验为基础研究了不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响,利用Mintab15软件响应面分析法优化在转糖基β-半乳糖苷酶活性最大时的最佳金属离子浓度、表面活性剂的添加量及加入时机。结果表明,发酵培养基中镁离子浓度为0.031%,吐温-80添加量为0.24%,钾离子浓度为0.047%时,最有利于提高转糖基β-半乳糖苷酶的活性且酶的活性最大。为保持产酶过程中β-半乳糖苷酶的最大活性,在菌体生长对数期的初期,OD值为1.6时添加0.2%的吐温-80,添加过早或过晚都会影响转糖基β-半乳糖苷酶的活性。     

乳酸菌质粒研究

乳酸菌质粒编码许多重要的代谢特性,对优良菌株的育种和食品级载体的构建均具有重要意义.本试验研究发现德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜酸乳杆菌存在23kb的质粒;28kb的质粒也存在于乳酸乳球菌乳酸亚种中.乳酸菌属于革兰氏阳性菌,菌体裂解不彻底;质粒拷贝数低,提取比较困难.     

十一种香辛料对乳酸菌生长及抑菌性的影响

主要研究了不同香辛料对嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌生长及抑菌性能的影响。选取白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香叶、芫荽子、辣椒这11种香辛料,以水作为提取剂加热浸提,制备香辛料提取液。研究不同香辛料对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL生长的影响,并以两种常见食源性致病菌大肠杆菌Escherichia coli O157:H7ATCC 43895、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003为指示菌株,采用牛津杯法测定不同香辛料对乳酸菌发酵液抑菌性的影响。结果表明,香辛料浓度为20mg/mL时,丁香对嗜酸乳杆菌LA的增殖抑制作用最明显,其次为香叶;八角对乳酸乳球菌LL的增殖抑制作用最明显。白芷、高良姜、白胡椒、花椒、芫荽子对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL的生长影响较小。高良姜能明显提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌的抑菌性;辣椒能明显提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌性;丁香则明显降低嗜酸乳杆菌发酵液对大肠杆菌的抑菌活性。香叶的添加有利于提高乳酸乳球菌发酵液对大肠杆菌的抑菌活性,花椒的添加有利于提高乳酸乳球菌LL对金黄色葡萄球菌的抑菌性。白芷、高良姜、生姜等多数香辛料的添加会降低乳酸乳球菌LL发酵液对大肠杆菌Escherichia coli O157:H7ATCC 43895、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003的抑菌性。嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL发酵液对大肠杆菌Escherichia coli O157:H7ATCC 43895、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003的抑菌活性主要受pH的影响,抑菌活性成分主要为有机酸类或受酸度影响的物质。泡菜等相关生产发酵过程中通过选择适宜的乳酸菌菌种及香辛料,能起到有效防止致病菌污染的作用,更有利于实现生产的安全性控制。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

克雷伯氏菌产β-半乳糖苷酶的异源表达及低聚半乳糖合成工艺优化

β-半乳糖苷酶是低聚半乳糖制备过程中的关键酶。本文克隆生菌株克雷伯氏菌B5582Y的β-半乳糖苷酶基因lacZ,并成功构建大肠杆菌重组质粒pET28a-24。经IPTG诱导表达其酶活力比野生菌株提升近10倍。通过单因素及响应面法考察重组酶对低聚半乳糖合成的影响,得到最佳工艺条件为:加酶量130 U/mL,温度44℃,底物添加量90%,pH 7.0～7.5,反应时间10 h,低聚半乳糖的产率达44%。重组酶表现出较好的转糖苷活性,在低聚半乳糖合成领域具有较大的应用潜力。     

传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。