乙型肝炎病毒变异对其特异性CTL反应的影响

特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）反应是人体清除ＨＢＶ的主要机制，与临床结局密切相关，了解病毒变异对ＣＴＬ反应的影响尤为重要。 １．ＣＴＬ表位区内的变异：ＣＴＬ通过识别ＨＢＶ抗原特异性表位而清除病毒，ＨＢＶ编码的蛋白产物上都有这种表位。表位区内的变异可能引起（１）与ＨＬＡ分子结合的病毒抗原肽“错位变异”，抗原提呈失败；（２）ＣＴＬ不能识别变异的表位；（３）变异性肽配体与ＣＴＬ受体结合，使ＣＴＬ分化信号发生改变而失去对靶抗原的杀伤作用。但ＨＢＶ可表达多种抗原性、且变异绝大多数不在表位区内，个别ＣＴＬ…     

不同肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导CTL活性的研究

目的比较不同方法提取的肝癌细胞(SMMC-7721)抗原致敏树突状细胞(Dendritic cell DC)后,对特异性细胞毒性T细胞(CTL)的诱导作用。方法分离脐带血单个核细胞,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出脐血DC;SMMC-7721细胞经反复冻融,直接超声破碎及热休克处理后再超声破碎细胞三种方法提取肿瘤抗原,然后分别致敏DC,以MTT法检测脐血DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。结果热休克处理后再超声破碎法提取的抗原致敏DC,能诱导更强的刺激T细胞增殖的能力,并且可以诱导更强的CTL活性。结论加热处理后再超声破碎细胞提取的肿瘤抗原致敏DC,在体外可诱导强大的抗肿瘤免疫保护效应。     

乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的实验研究

目的 探讨DNA疫苗pCI-S-IRES-ProTα接种小鼠后的免疫反应变化。方法 用基因重组技术构建DNA疫苗,脂质体介导转染NIH－3T3细胞,并给小鼠进行DNA疫苗接种。ELISA检测HBsAg、抗－HBs,RT－PCR检测pCI-S-IRES-ProTα的表达。结果 pCI-S-IRES-ProTα、pCI-S在细胞中高效表达,pCI-S-IRES-ProTα接种小鼠产生的体液反应和特异淋巴细胞增殖反应强于pCI-S组。结论 ProT α可增强接种小鼠的免疫反应。     

慢性乙型肝炎患者CD28的表达及CTL、Ts的研究

目的 测定慢性乙型肝炎患者外周血清中CD8+、CD28分子的表达,探讨HBV感染过程中乙型肝炎病毒免疫清除和免疫调节的发病机制,为其临床治疗提供理论依据.方法 随机选取2005年7月至2006年7月临沂市人民医院感染科病房住院慢性乙型肝炎患者45例为观察组,用流式细胞术检测CD4+、CD8+细胞CD28表达.结果 慢性HBV感染组与正常对照组比较,慢乙肝组CD28+T细胞的百分数均明显升高,差异有显著意义(P＜0.01);在CD8+T细胞中,CD8+CD28+T细胞明显下降,差异有显著意义(P＜0.05);CD8+CD28-T细胞明显升高,差异有显著意义(P＜0.01).Child-pugh分级A、B、C级各组之间CD28+无显著差异(均P＞0.05);CD8+CD28+ 或CD8+CD28-细胞在A、B、C级各组之间差异有显著意义(P＜0.01).CD8+CD28+与HBeAg、HBV-DNA相关系数分别为-0.33、-0.44,均呈负相关;CD8+CD28-与HBeAg、HBV-DNA相关系数分别为0.31、0.33,均呈正相关;CD8+CD28+、CD8+CD28-两者之间相关系数为-0.72,呈负相关.结论 CD28分子对慢性乙肝免疫调节有重要作用,CD28分子的表达与肝脏的炎症程度无关;CTL应答随炎症程度的增高而增强,炎症程度越高细胞毒反应越明显,更有利于病毒的清除.Ts具有免疫抑制作用,且Ts的抑制作用随炎症程度的增高而降低.CTL细胞有助于病毒的清除,而Ts细胞则在病毒清除过程中起抑制作用.     

LDH法检测pcDNA-HPV16L1免疫小鼠CTL活性的研究

目的观察pcDNA—HPV16L1免疫BALB／c小鼠细胞毒性T细胞（CTL）活性变化,建立简便易行的CTL检测体系,为人乳头瘤病毒（HPV）疫苗免疫中CTL作用的研究奠定基础。方法用pcDNA—HPV16L1转染的小鼠黑色素瘤B16细胞作为靶细胞,用pcDNA—HPV16L1免疫BALB／c小鼠（观察组）并以乳酸脱氢酶（LDH）法检测其CTL活性,设空质粒组与空白组作为对照（分别肌注空质粒和葡萄糖）。结果与空质粒组和空白组比较,观察组CTL活性显著增强。结论pcDNA—HPV16L1免疫小鼠的CTL活性增强,LDH法可稳定检测。     

负载食管癌抗原的DC诱导特异性CTL对食管癌细胞体外杀伤作用观察

目的观察负载食管癌抗原的树突状细胞（DC）活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对食管癌细胞的体外杀伤作用。方法冻融法获取食管癌细胞抗原,联合应用粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导培养外周血DC并负载肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,制备特异性CTLs。将其加入食管癌细胞中培养48 h,用MTT法检测食管癌细胞裂解率,ELISA法检测γ干扰素（γ-IFN）水平。结果负载食管癌抗原的DC激活的CTLs表现出对食管癌Eca109细胞的特异性杀伤作用,γ-IFN水平为（1 625±37.55）pg/ml;而对A549细胞仅有微弱的杀伤作用,γ-IFN水平为（169.04±13.81）pg/ml。未负载食管癌抗原DC刺激的CTLs对食管癌细胞几无杀伤作用。结论负载食管癌抗原的DC激活的CTLs在体外对食管癌细胞能产生高效而特异性的杀伤作用。     

乙型、丙型肝炎DNA疫苗单次联合接种后小鼠的免疫应答

目的：观察由编码ＨＢｓＡｇ与ＨＣＶ－ＣＥ２抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的ＤＮＡ疫苗联合接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后,其施生行异性免疫应答的规律和相互影响。方法：应用上述２种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠,动态观察血中特生抗体水平;并完成稳定转染,表达相应抗原的ＳＰ２／０骨髓瘤细胞的建株,采用ＣＴＬ杀伤活性体内诱生实验的方法建立观察ＤＮＡ疫苗免疫保护与治疗泊动物模型。结果：两种ＤＮＡ疫苗单次联合免疫小鼠     

丙型肝炎病毒多细胞毒性T淋巴细胞表位DNA疫苗诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应

本研究通过构建含有两个丙型肝炎病毒（HCV）细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（Core133-142和El315-322）的多HCVCTL表位DNA疫苗，用其免疫小鼠，研究其引起的特异性CTL应答，以明确由多个HCVCTL表位基因编码直接连接构成的多CTL表位DNA疫苗，其各个HCVCTL表位是否能独立表达，引起各自相应的特异性CTL应答，且多个CTL的联合作用能否能增强总体的CTL杀伤效应，为构建有效安全的多CTL表位DNA疫苗提供理论基础。     

HBcAg特异性CTL在急性乙型肝炎与慢性乙型肝炎急性发作患者外周血中的数量差异

目的:研究急性乙型肝炎(AHB)与慢性乙型肝炎(CHB)急性发作患者外周血中HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的数量差异.方法:选择HLA-A2阳性的AHB患者17例和CHB患者13例作为研究对象,应用Tetramer流式细胞技术检测其外周血单个核细胞(PBMC)中的HBcAg特异性CTL细胞频率.结果:30份PBMC标本中测得HBcAg特异性CTL为0.071-31.610,而阴性对照的健康者PBMC标本检测值仅为0.003.AHB患者的HBcAg特异性CTL显著高于CHB患者(9.601±10.425vs0.259±0.193,P=0.002).结论:外周血中HBcAg特异性CTL的数量在AHB与CHB急性发作患者之间存在显著性差异,有望成为早期鉴别上述两种疾病状态的实验方法.     

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

目的观察人胰腺癌Mia Pa Ca-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将Mia Pa Ca-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1m RNA转染DC,以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 Mia Pa Ca-2总RNA与MUC1 m RNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02,两者比较无显著差异(P0.05)。电转染后96 h Mia Pa Ca-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%,低于MUC1 m RNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P0.05)。转染Mia Pa Ca-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432±611.25,显著高于MUC1单独转染组3 664±305.17(P0.05);且转染Mia Pa Ca-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 m RNA单独转染组(P0.05)。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。     

乙型及丙型肝炎DNA疫苗联合重复接种小鼠的免疫应答

目的 :观察由编码 HBs Ag与 HCV- CE2 抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的 DNA疫苗重复联合接种 BAL B/c小鼠后 ,其诱生的特异性免疫应答反应。方法 :应用上述两种 NDA疫苗重复联合免疫小鼠 ,动态观察血中特异性抗体水平、特异性细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )体外杀伤活性 ,并进行 CTL杀伤活性活体诱生实验。结果 :两种 DNA疫苗联合重复免疫小鼠 ,能够诱生机体特异性体液免疫及细胞免疫完全应答。其小鼠荷瘤表达目的抗原的靶细胞后 ,生存率明显高于未免疫鼠 (P <0 .0 5 )。结论 :乙型及丙型肝炎联合 DNA疫苗的重复接种 ,可有效地诱生小鼠机体特异性免疫应答反应。 DNA疫苗诱生的 CTL应答可与体液免疫应答分离存在 ,可能是 DNA疫苗免疫保护的更重要方面。     

Novel DNA vaccine based on hepatitis B virus core gene induces specific immune responses in Balb/c mice

AIM:To investigate the immunogenicity of a novel DNA vaccine,pSW3891/HBc, based on HBV core gene in Balb/c mice. METHODS:A novel DNA vaccine, pSW3891/HBc, encoding HBV core gene was constructed using a vector plasmid pSW3891. Balb/c mice were immunized with either pSW3891/HBc or empty vector DNA via gene gun. IgG anti-HBc responses in mouse sera were demonstrated by ELISA. Specific cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) of mice was quantitatively measured by lactate dehydrogenase release assay. RESULTS:HBcAg was expressed effectively in 293T cell line transiently transfected with pSW3891/HBc. Strong IgG anti-HBc responses were elicited in mice immunized with pSW3891/HBc. The end-point titers of anti-HBc reached the highest 1:97 200, 4 wk after the third immunization. The specific CTL killing with the highest specific lysis reached 73.25% at effector:target ratio of 20:1 in mice that received pSW389l/HBc DNA vaccine. CONCLUSION:pSW3891/HBc vaccination elicits specific anti-HBc response and induces HBc-specific CTL response in immunized Balb/c mice.     

乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的观察乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心区ＤＮＡ疫苗接种后ＢＡＬＢ／ｃ（－２ｄ）小鼠的特异性免疫应答。方法构建ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗（ＰＪＷ４３０３／ＨＢｃ）;用基因枪法和肌肉注射祛将该ＤＮＡ疫苗接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢＣ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果该ＤＮＡ疫苗在体外转染细胞中可良好表达ＨＢｃＡｇ。血清抗－ＨＢｃ终点滴度在ＤＮＡ疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为１：３２８０５０和１：１０９３５０．两组小鼠的抗－ＨＢｃＩｇＧ亚类均以ＩｇＧ２ａ略占优势。两组小鼠的ＨＢＣＡｔｈｅ异性ＣＴＬ杀伤活性分别达到５１．１％和５５．２％。结论ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞免疫及抗乙型肝炎病毒皮下移植瘤的研究

目的观察乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗(pCR3 1-S)诱导Balb/c小鼠(H-2d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞(P815 HBV-S)(H-2d)成瘤性的影响.方法肌肉注射DNA疫苗,背部皮下接种P815-HBV S细胞,观察成瘤情况,4h 51Cr释放法检测小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)杀伤活性.结果DNA疫苗可以降低成瘤率,抑制肿瘤生长,延长小鼠平均存活期,提高小鼠存活率.CTL细胞杀伤活性明显增加(P＜0.001).结论DNA疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内HBV感染可能具有预防及治疗作用.     

日本血吸虫双价DNA疫苗体内外表达及持续时间的初步研究

目的观察日本血吸虫双价DNA疫苗在体内外表达及体内表达的持续时间。方法将构建的共表达日本血吸虫双价核酸疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj23瞬时转染HEK-293细胞,通过逆转录(RT-PCR)和间接免疫荧光试验(IFAT)检测真核细胞中SjFABP和Sj23基因及蛋白的表达。质粒经股四头肌注射免疫BALB/c小鼠12只,每月眼眶采血,并活体灌流小鼠2只,IFAT检测重组蛋白的原位表达,Westernblot法检测血清中特异性抗体,持续观察6个月。结果RT-PCR和IFAT证明质粒pVIVO2-SjFABP/Sj23能在体外表达。免疫后连续6个月,IFAT均检测到小鼠骨骼肌注射部位重组蛋白的原位表达,但Westernblot未检测到血清中特异性抗体的存在。结论日本血吸虫双价DNA疫苗在HEK-293细胞和小鼠骨骼肌中均能够正确地表达,体内表达持续时间至少在6个月以上。     

宫内HBV感染接种乙型肝炎疫苗小儿的细胞免疫功能的研究

为了探讨宫内乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染接种乙型肝炎（ＨＢ）疫苗失败的原因，采用体外淋巴细胞培养方法对４２例宫内ＨＢＶ感染接种ＨＢＶ疫苗小儿进行了非特异性及特异性淋巴细胞增殖试验的检测，同时应用间接免疫荧光技术对其中３２例进行外周血Ｔ淋业群的测定。结果非特异性及特异性淋巴细胞增殖试验宫内ＨＢＶ感染接种ＨＢＶ疫苗无反应组ＳＩ值均低于有反应组及正常免疫儿童，ＣＤ＾＋４／ＣＤ＾＋８值在宫内ＨＢＶ感染接种Ｈ     

DNA vaccination in rhesus macaques induces potent immune responses and decreases acute and chronic viremia after SIVmac251 challenge

Optimized plasmid DNAs encoding the majority of SIVmac239 proteins and delivered by electroporation (EP) elicited strong immune responses in rhesus macaques. Vaccination decreased viremia in both the acute and chronic phases of infection after challenge with pathogenic SIVmac251. Two groups of macaques were vaccinated with DNA plasmids producing different antigen forms, “native” and “modified,” inducing distinct immune responses. Both groups showed significantly lower viremia during the acute phase of infection, whereas the group immunized with the native antigens showed better protection during the chronic phase (1.7 log decrease in virus load, P = 0.009). Both groups developed strong cellular and humoral responses against the DNA vaccine antigens, which included Gag, Pol, Env, Nef, and Tat. Vaccination induced both central memory and effector memory T cells that were maintained at the day of challenge, suggesting the potential for rapid mobilization upon virus challenge. The group receiving the native antigens developed higher and more durable anti-Env antibodies, including neutralizing antibodies at the day of challenge. These results demonstrate that DNA vaccination in the absence of any heterologous boost can provide protection from high viremia comparable to any other vaccine modalities tested in this macaque model.     

小鼠接种rHBs疫苗产生的特异性淋巴细胞增殖反应

目的　研究小鼠免疫接种基因重组乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant hepatitis B virus(HBV)surface vaccine,rHBs)产生的特异性淋巴细胞增殖反应。方法　40只BALB／c小鼠随机分为0.65、1.25、2.5、5 μg四组,腹腔分别接种0.65、1.25、2.5、5 μg的rHBs,一半4、鼠2周后加强免疫1次。分别在初次免疫后2周或加强免疫后2周分离小鼠脾T淋巴细胞;分别进行以下实验:实验组用rHBs(10 μg／m1)刺激脾T淋巴细胞,对照组用PBS代替rHBs刺激脾T淋巴细胞;3天后用3H掺入法检测脾T淋巴细胞特异性增殖反应,以3H掺入的同位素cpm值及刺激指数(Stimulation index,SI,实验组cpm值／对照组cpm值)表示。结果 只接受单次免疫的0.65,1.25,2.5,5 μg组小鼠脾T淋巴细胞特异性增殖反应SI分别为1.55、1.93、2.41、2.81;而接受加强免疫的0.65、1.25、2.5、5 μg组小鼠脾T淋巴细胞特异性增殖反应SI分别为1.61、2.05、3.74、3.62。结论 小鼠接种rHBs后产生特异性淋巴细胞增殖反应,加强免疫或增加接种剂量可以增强反应强度。     

HBcAg DNA疫苗诱导小鼠（H—2^b）特异性细胞和体液免疫应答

目的 观察ＨＢｃＡｇ ＤＮＡ疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（Ｈ－２＾ｂ）的特异性细胞和体液免疫应答。方法 基因枪和肌肉注射两种方法接种ＤＮＡ疫苗;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;＾５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果 该ＤＮＡ疫苗体外可表达ＨＢｃＡｇ;小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗－ＨＢｃ滴度分