阿霉素对不同转移能力肝癌细胞及肝癌干细胞相关基因表达的影响

目的 探讨阿霉素（adriamycin, ADM）对不同转移能力肝癌细胞及肝癌干细胞相关基因表达的影响。方法　利用MTT法检测ADM对人肝癌细胞系MHCC97-L、HCCLM3的抑制作用,计算各自的半数致死浓度（median lethal dose, LD50）;Western blot法检测ADM作用下人肝癌细胞系MHCC97-L、HCCLM3中干细胞基因Nanog、Oct-4、Sox2、ARID1A、Wnt5b的表达,并分析干细胞基因在两种细胞中表达变化的差异。结果 ADM浓度越高,对人肝癌细胞的抑制作用越明显,其对MHCC97-L和HCCLM3的半数致死浓度分别为0.4212 μmol/L和0.5249 μmol/L;随着ADM（LD50）作用时间的延长,MHCC97-L和HCCLM3中Wnt5b的表达水平先升高后降低,Nanog蛋白的表达先降低后升高,Sox2在HCCLM3中表达水平逐渐升高。Wnt5b和Nanog 4 h内在低转移能力肝癌细胞系MHCC97-L中的表达变化均值均小于其在高转移能力肝癌细胞系HCCLM3时的表达变化均值,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 ADM可促进MHCC97-L和HCCLM3细胞的凋亡,且对MHCC97-L的作用强于HCCLM3;干细胞相关基因Wnt5b与肝癌细胞的恶性程度呈负相关;Nanog和Sox2均与肿瘤的转移密切相关,且Nanog和Sox2可能与肝癌耐药密切相关。     

应用CpG岛芯片技术分析人肝癌细胞株CpG岛甲基化差异基因

目的 在全基因组水平研究与肝细胞癌发生及转移相关的cpc岛甲基化谱型改变.方法 采用加拿大University Health Network芯片中心的12K人CpG岛芯片,对多系列人肝癌细胞株HepB、HepG2、PLC/RPF/5/RPF/5、SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和HCCLM6进行全基因组CpG岛甲基化差异扫描,以Chang's liver细胞株为对照.其中MHCC97系列细胞株(MHCC97-H、HCCLM3、HCCLM6)均以低转移潜能细胞株MHCC97-L作为对照,筛选转移潜能相关差异基因.对数据进行归一化处理及聚类分析,筛选出具有甲基化差异的基因,并随机选取2个基因进行甲基化特异性PCR(MSP)验证.结果 以Cy5/cy3≥2或者≤0.5为差异显著性标准,筛选出9个肝癌细胞株中差异表达趋势一致的CpG岛差异甲摹化位点58个,其上下游肿瘤相关基因66个,包括抑癌基因及其配体基因、凋亡基因及抗凋亡基因、细胞增殖分化基因、细胞周期相关基因、细胞信号通路关键基因等.MHCC97系列高转移潜能细胞株MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6筛选出转移潜能相关CpG岛甲基化差异位点分别为16、13和6个,肿瘤相关基因分别为24、16和6个.MSP验证与芯片结果相符.结论 在肝癌的发生、发展过程中,存在一系列关键基因CpG岛甲基化改变.在肝癌细胞株中,抑癌基因及相关信号通路关键基因可能由于其启动子区CpG岛高甲基化而表达下调,而促癌基因及相关信号通路关键基因可能由于其启动子区CpG岛低甲基化而上调表达.     

LASS2基因抑制HCCLM3肝癌细胞的转移

目的：探讨LASS2基因对HCCLM3肝癌细胞转移的影响。方法：Northern blot分析高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3和低转移潜能肝癌细胞系MHCC97-L中LASS2基因的mRNA水平。构建包含LASS2基因编码框的真核表达载体pCMV—HA2-LASS2，通过脂质体转染HCCLM3细胞，经G418筛选，建立稳定表达LASS2基因的HCCLM3细胞株。通过分析LASS2在HCCLM3中过表达后，HCCLM3细胞在迁移、侵袭等转移能力上的改变，Western blot、明胶酶谱及原位酶谱分析MMP-2合成、分泌、激活的变化。结果：Northern blot显示，HCCLM3细胞中LASS2基因的表达水平低于MHCC97-L细胞。当LASS2基因过表达后，HCCLM3细胞的迁移及侵袭能力受到显著抑制（P〈0．001），虽然细胞内MMP-2的合成未改变，但细胞MMP-2的分泌及MMP-2的激活均受抑制。结论：LASS2基因可下调MMP-2的分泌及激活，可使肝癌细胞HCCLM3的转移能力受到明显抑制，提示LASS2基因对肝癌细胞HCCLM3的转移具有抑制作用。     

TEY1基因在不同转移潜能肝癌细胞中表达的定量分析

背景和目的:我们先前的研究提示,肝癌转移抑制基因可能在人染色体8p上。TEY1基因(TEnni-Yokusei1,转移抑制的日文)是最近从人染色体8p发现的前列腺癌转移抑制基因。本研究通过对不同转移潜能肝癌细胞株中TEY1基因的表达水平进行定量分析,探讨TEY1基因作为肝癌转移抑制基因的可能性。方法:提取肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和正常肝细胞系L02的RNA,反转录合成第一链cDNA,对反转录产物进行荧光定量PCR。用看家基因GAPDH的cDNA起始浓度作为参照标化TEY1的cDNA起始浓度,对标化结果进行单因素方差分析。结果:MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和L02标化后的TEY1cDNA起始浓度分别为(3.57±2.62)×10-4、(5.02±1.95)×10-4、(2.82±0.78)×10-5、(15.20±0.58)×10-4。肝癌细胞的TEY1基因表达水平和正常细胞之间存在显著性差异(P<0.001);HCCLM3的TEY1基因表达水平与MHCC97-H和MHCC97-L相比差异有显著性(P<0.05);MHCC97-L的TEY1基因表达水平是MHCC97-H的1.4倍,但两者无显著性差异(P>0.05)。结论:TEY1基因表达水平与肝癌细胞的转移潜能呈负相关,可以推测TEY1基因可能是肝癌转移的抑制基因。     

人胃癌腹膜高转移潜能细胞系的基因表达分析

目的:比较人胃癌细胞系与其腹膜高转移潜能细胞系的基因表达谱,寻找与胃癌腹膜转移相关的基因表达改变。方法:采用基因芯片技术,比较遗传背景相同但转移力有明显差异的两个细胞系GC9811和GC9811-P,分析其基因表达谱的差异。选取部分基因行RT-PCR进一步验证基因芯片的准确性。结果:在11901个候选基因中,筛选出248个(2.1%)差异表达基因。GC9811-P与GC9811相比,表达上调的基因有218个,下调的有30个,包括DNA合成和错配修复基因如H3F3A、细胞增生基因、蛋白合成与修饰基因、信号传导基因和离子通道与运输蛋白相关基因等。半定量RT-PCR对PTEN、S100A4和ZNRD1基因检测结果验证了基因芯片数据的可靠性。结论:胃癌腹膜转移是多基因作用的综合结果,筛选的基因对预测胃癌腹膜转移和抗转移干预措施可能有指导意义。     

miR-509-3p在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞迁移侵袭的影响

背景与目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内致死率第三高的恶性肿瘤，microRNA（miRNA）被认为在HCC的发病机制中起重要作用。本研究旨在探讨在原发性肝癌中miR-509-3p的表达水平、细胞功能及调控的相关基因。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技术检测miR-509-3p在46例肝癌患者组织样本、人肝癌细胞系及永生化人正常肝细胞系中的表达水平，采用transwell实验检测miR-509-3p对肝癌细胞转移的影响。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测miR-509-3p与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）之间的关系。结果：RTFQ-PCR技术检测结果显示，miR-509-3p在46例肝癌患者的肝癌组织样本以及MHCC97H、HCCLM3和SMMC-7721肝癌细胞系中异常高表达。体外功能实验证实抑制miR-509-3p表达能降低MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞的迁移能力。Western blot检测结果显示，在MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞中抑制miR-509-3p的表达可以降低MMP-9和MMP-2蛋白的表达。结论：本研究表明miR-509-3p通过正向调控MMP-9和MMP-2蛋白的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。     

c—met—SF／HGF基因表达对肝癌细胞转移能力的影响

目的：研究c-met-SF/HGF基因表达对肝癌细胞转移能力的影响。方法：采用RT－PCR及Wiestern Blot法检测肝癌细胞株MHCC－1、HepG2,Hep3B,SMMC7721的met-SF/HGF的表达，继而用c-met多克隆抗体阻断met-SF/HGF的信号传导，观察细胞各项能力的改变。结果：转移能力高的细胞株（MHCC－1）c-met的表达量远高于转移能力低的细胞株，并伴有配体SF／HGF的自分泌；MHCC－1上清液能刺激SMMC7721细胞增殖并使其运动能力增强；该作用被抗c-met抗体特异性阻断，当被阻断后，细胞生长及运动能力下降。结论met-SF/HGF 基因表达在肝癌转移中起重要的作用，阻断c-met-SF/HGF的信号传导将降低肿瘤转移的能力。     

高转移潜能肝癌HCCLM3细胞中侧群细胞的分离及其干细胞特性鉴定

目的:检测高转移潜能肝癌HCCLM3细胞株中侧群(side population,SP)细胞比例,分选SP细胞并探讨其生物学特性。方法:4种肝癌细胞株的转移潜能大小依次为HCCLM3>MHCC97H>MHCC97L>Huh7,分别予以荧光染料Hoechst33342染色,以加入维拉帕米的拮抗组为对照,流式细胞术检测SP细胞比例;从HCCLM3细胞中分选SP细胞和主群(main population,MP)细胞,采用悬浮球培养、Transwell侵袭实验及裸鼠成瘤实验判断HCCLM3 SP细胞是否具备肿瘤干细胞生物学特性;RT-PCR检测SP及MP细胞中干细胞相关基因的表达。结果:HCCLM3细胞中SP细胞比例为(16.9±1.8)%,显著多于MHCC97H、MHCC97L、Huh7中SP细胞比例[(8.4±0.7)%、(4.6±0.5)%、(1.0±0.2)%,均P<0.05]。HCCLM3细胞中,SP细胞悬浮球形成明显高于MP细胞[(25.3±5.1)%vs(11.2±2.6)%,P<0.05],SP细胞的侵袭能力显著高于MP细胞(P<0.05),SP细胞的裸鼠皮下成瘤能力也明显高于MP细胞。HCCLM3细胞的SP细胞中干细胞相关基因ABCG2、CD13、CD44、Nanog、Sox2及Klf4 mRNA平均表达水平分别是MP细胞的5.64、2.26、2.10、3.78、2.37、2.92倍(均P<0.05)。结论:肝癌HCCLM3细胞的SP细胞中富集了肝癌干细胞,这可能与其较高的转移潜能有关。     

DLC-1基因表达对HCCLM3细胞基质金属蛋白酶分泌相关性的研究

目的:观察DLC-1蛋白表达对肝癌高转移细胞系HCCLM3细胞基质金属酶分泌的影响,进一步研究DLC-1基因在肝细胞癌转移复发中的作用.方法:构建peDNA3.1(-)-DLC-1重组表达质粒,用脂质体转染方法转染肝癌高转移细胞系HCCLM3,通过ELISA、明胶酶谱方法,研究重组质粒转染后对HCCLM3细胞基质金属蛋白酶分泌的影响.结果:成功构建peDNA3.1(-)-DLC-1重组质粒后转染高转移肝癌细胞系,重组质粒转染组HC-CLM3细胞培养上清中MMP-2和MMP-9分别为(46.887±2.03)和(34.683±1.98)ng/mL含量低于未处理的HC-CLM3细胞组[(47.172±2.12)和(34.468±2.54)ng/mL]和空质粒转染组[(35.528±2.89)和(31.542±2.38)ng/mL],其中MMP-2的降低差异有统计学意义.结论:DLC-1基因表达可降低细胞基质金属蛋白酶的分泌,与肝细胞癌的侵袭转移密切相关,可能是肝癌的转移抑制相关基因之一.     

CTHRC1基因在人肝癌中高表达并促进MHCC97L肝癌细胞的转移

目的：分析CTHRC1基因在人肝癌组织和肝癌细胞株中的表达情况及其对MHCC97L肝癌细胞转移能力的影响。方法：采用northem blot、RT—PCR和荧光定量PCR分析人肝癌组织和肝癌细胞株中CTHRC1 mRNA水平。构建包含CTHRC1基因编码框的真核表达载体pCMV-3Tag-CTHRC1，通过体外实验分析CTHRC1在MHCC97L细胞中过表达对MHCC97L细胞迁移、侵袭等转移能力的影响。结果：Northern blot、RT—PCR和荧光定量PCR结果显示，14例肝癌患者中11例存在癌组织CTHRC1 mRNA表达水平高于癌旁组织，8种肝癌细胞株中5种肝癌细胞株存在着CTHRC1的高表达。当CTHRC1过表达后，MHCC97L细胞的迁移及侵袭能力显著增强（P〈0．001）。结论：CTHRC1基因在人肝癌组织和人肝癌细胞株中存在着高表达，同时该基因可使肝癌细胞MHCC97L的转移能力明显增强，提示CTHRC1基因可能在肿瘤转移中起重要作用。     

HTPAP gene on chromosome 8p is a candidate metastasis suppressor for human hepatocellular carcinoma

Our previous studies suggested that chromosome 8p deletion is associated with metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC), in which some novel metastasis suppressor genes might be harbored. The present study aimed to identify the metastatic suppressor gene(s). A cDNA chip was constructed with the expressed sequence tags (ESTs) from chromosome 8p and used to compare the difference of expression profiling between the MHCC97-H and MHCC97-L cell lines with different metastatic potentials and similar genetic backgrounds. In all, 10 ESTs were significantly downregulated in MHCC97-H cell line with higher metastatic potential. One full-length gene, HTPAP (phosphatidic acid phosphatase type 2 domain containing 1B), was identified at chromosome 8p12. Sequencing and bioinformatic analyses revealed that HTPAP has 826 bp and encodes a putative protein of 175 amino acids with a transmembrane segment at the NH2 terminus, two protein kinase C phosphorylation site and one tyrosine kinase phosphorylation site. Its expression level in metastatic tumor tissues was much lower than that of primary HCC tissues. Both in vitro and in vivo assays suggested that HTPAP could suppress the invasion and metastasis of HCC. These suggested that HTPAP is a novel metastatic suppressor gene for HCC. The mechanism of the effect of HTPAP on HCC metastasis is not clear yet and deserves further investigation.     

鼻咽癌不同转移潜能细胞株基因表达的差异

目的：描绘鼻咽癌细胞株不同转移潜能亚株的基因表达谱,以筛选鼻咽癌新的肿瘤相关及转移相关候选基因,方法：用含14000个cDNA克隆的表达微阵列分析鼻咽癌细胞株SUNE－1的3个亚株,即高转移潜能细胞株5－8F,成瘤不转移株6－10B和不成瘤株13－9B的mRNA表达;用半定量RT－PCR验证cDNA表面微阵列检测的结果。结果：5－8F与13－9B比较,有82个差异表达基因;6－10B与13－9B比较,有38个差异表达基因,5－8F与6－10B比较,有54个差异表达基因,5－8F及6－10B与13－9B比较,有12个共有的差异表达基因;5－8F与13－9B及6－10B比较,有14个共有的差异表达基因。这些基因涉及代谢,转录,分化,凋亡和信号转导等多种生物功能以及许多未知功能,结论：揭示了鼻咽癌细胞株的基因表达谱,为寻找鼻咽癌相关基因提供了重要线索。     

基因芯片筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关基因

背景与目的肿瘤转移是一个多基因参与的复杂过程。由肿瘤转移所导致的恶性肿瘤患者死亡率高、预后差和其发生机制不清,长期以来一直是肿瘤学领域的突出问题。本研究利用基因芯片技术比较高低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞系Hca-F(高转移)和Hca-P(低转移)的基因表达谱,并筛选出与肿瘤淋巴道转移相关的基因。方法分别提取Hca-F和Hca-P细胞的总RNA,反转录合成双链cDNA,通过体外反转录合成生物素标记的cRNA探针,cRNA探针经片段化处理后分别与AffymetrixGeneChip誖MOE430A(包括22690个转录本对应于约14500个小鼠已知基因和4371个EST)杂交,杂交信号经扫描等处理并用生物信息学对检测结果进行分析。结果与Hca-P细胞相比较,Hca-F细胞中有901个(6.2%)基因表达上调幅度≥2倍,有129个(3%)EST上调幅度≥2倍。在公布的差异最显著的33个包括endoglin(EDG;CD105)、Mcam(Muc18;Mel-CAM;CD146)、Cdc42ep5(CEP5;Borg3)、Ptprr(proteintyrosinephosphatase,receptortype,R)、F2r[coagulationfactorⅡ(thrombin)receptor;Par1;ThrR]、D7Ertd458e(necl-5)、NR1D1、Serpinh1(HSP47)、AXL、Mak和Areg(AR)等基因表达中,上调幅度在29.86～13.93倍之间。根据GO(GeneOntology)分类和Treeview分析,这33个基因的功能主要为促血管生成、细胞粘附、信号转导、细胞运动、转录、分子伴侣活性、蛋白激酶活性和受体结合等。结论高通量的基因芯片技术筛选出大量淋巴道转移相关基因,对这些转移相关基因功能的验证有助于找到淋巴道转移的关键(代表)基因/通路,它们可作为肿瘤淋巴道转移诊断的指标和治疗的靶点。     

肝癌高低转移细胞株差异表达基因的初步研究

目的：肝癌高低转移细胞株的基因表达谱的比较。方法：应用cDNA microarray技术，对肝癌高低转移细胞株的基因表达谱进行比较，并应用RT—PCR对部分差异表达的基因进行了验证。结果：肝癌高转移细胞株与低转移细胞株相比，有384个基因存在差异表达，其中12个是位于染色体8p上。选取4个基因用RT—PCR验证，结果与cDNA microarray结论基本一致。结论：肝癌高低转移细胞株基因表达存在明显差别。染色体8p上可能存在促进和抑制肝癌转移的基因。     

Programmed cell death 4 (PDCD4) suppresses metastastic potential of human hepatocellular carcinoma cells

Background

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a lethal malignancy with high rate of metastasis and poor prognosis. There are no effective managements to block metastasis of HCC. Programmed cell death 4 (PDCD4) is found to be a tumor transformation suppressor. Among investigations on effects of PDCD4, little is about the metastatic potentials of HCC cells. This study was to investigate the role of PDCD4 on metastatic potential of human HCC cells.

Methods

We examined the expression of PDCD4 in three HCC cell lines with different metastatic potentials, MHCC-97H (high metastatic potential), MHCC-97L (low metastatic potential) and Hep3B (no metastatic potential). A plasmid encoding PDCD4 gene was constructed and then transfected into HCC cells with the lowest PDCD4 expression level. Effects of PDCD4 on cell proliferation, cell apoptosis, gene expression of metastasis tumor antigen 1 (MTA1) and in vitro migration and invasion capacity were assessed after transfection.

Results

Our results showed that the expression level of PDCD4 was inversely correlated to the metastatic potential of HCC cells. After transfection with the PDCD4 gene, HCC cell proliferation rate was significantly decreased, cell apoptosis rate was significantly increased, the expression of MTA1 gene, HCC cell migration and Matrigel invasion were also remarkably inhibited.

Conclusion

PDCD4 expression is inversely correlated to the metastatic potential of HCC cells. PDCD4 can effectively suppress the metastatic potential of HCC cells.