绿色木霉pH响应因子编码基因TvPacC的功能分析及应用

真菌所处环境的pH值一直处于不断变化之中,这对真菌的生长发育具有重要的影响。真菌为了适应不断变化的环境,进化出了pH响应信号途径,即Pal途径,而PacC是该途径中的关键调节因子。本文针对绿色木霉TvPacC基因的功能进行了分析研究。通过融合PCR结合原生质体转化技术构建了绿色木霉Tv-1511-△TvPacC缺失突变菌株,研究了TvPacC基因在木霉适应碱性环境和木霉菌株产碱性蛋白酶中的功能和应用。结果表明,相比较于野生型,Tv-1511-△TvPacC菌株具有更好的碱性环境的适应能力,而且敲除了TvPacC基因显著增强了木霉菌株产碱性蛋白酶的能力,提高了发酵液中碱性蛋白酶的产量和活性。因此,TvPacC在提高绿色木霉碱性环境的适应能力和木霉菌株产碱性蛋白酶能力等方面起着重要作用。     

短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.     

碱性蛋白酶的异源表达及其在制备CPP中的应用

碱性蛋白酶是现代工业酶制剂中最重要的酶类之一,在人类日常生活中扮演着非常重要的角色.本研究以嗜碱芽胞杆菌(B.alcalophilus)TCCC11006基因组为模板,从中扩增出碱性蛋白酶基因apr,并构建重组表达质粒p HYapr,将重组质粒电转入蛋白酶基因缺失的地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)H115中,实现了碱性蛋白酶的分泌表达.重组菌在LB培养基中最高酶活力达到3,199,U/m L,是出发菌株酶活力的1.82倍,发酵周期缩短了8,h.然后通过单因素和正交实验对重组碱性蛋白酶水解酪蛋白的工艺参数进行优化,确定了最佳水解温度、p H和酶添加量分别为50,℃、9.5和4,000,U/g.在最佳水解条件下,通过钡-乙醇沉淀的方法制备生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(CPP),其得率和氮磷物质的量比分别为14.8%,和8.47.这为碱性蛋白酶在功能性食品制造方面的应用奠定了良好的基础.     

酶解制备牦牛乳酪蛋白降血压肽的初步研究

目的:牦牛乳富含酪蛋白,其经酶解制备的降血压肽以安全性高、无副作用等优点已成为乳品开发和高血压防治药物研究的新热点.方法:本实验对从牦牛乳中提取的酪蛋白,依据复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶各自的最适pH及温度采用酶解方法制备降血压肽,并且以ACE抑制活性为指标初步筛选最佳水解酶.结果:五种酶ACE抑制肽抑制率分别为:复合蛋白酶为39.02%,中性蛋白酶为67.48%,碱性蛋白酶为56.10%,木瓜蛋白酶为71.54%,胰蛋白酶为8.94%.结论:说明,在最适pH及温度条件下,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶为制备降血压肽的最佳酶选,这为后续进一步的制备降血压肽实验提供依据.     

米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性

米曲霉碱性蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力和较好的脱苦作用.为了便于大量获得该酶以利于工业上的应用,文中通过RT-PCR克隆获得米曲霉碱性蛋白酶基因,将之转化到毕赤酵母KM71菌株中并成功表达,之后用该酶进行牛胰岛素氧化链B链及大豆和花生蛋白的水解试验.结果显示:在10L发酵罐中诱导表达时,发酵液中重组碱性蛋白酶的酶活达4100U/mL;该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5 ～9.5和50℃,在pH值为6.0 ～10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性;该酶具有广泛的肽键选择性;该酶对大豆和花生蛋白显示出了强于部分商品化蛋白酶的水解能力.以上结果表明:该重组蛋白酶具有较大的开发利用潜力.     

微生物碱性蛋白酶的研究与开发

微生物碱性蛋白酶被广泛应用于洗涤、食品、皮革及纺织等制造工业中.本文围绕碱性蛋白酶的研究与开发,对微生物碱性蛋白酶的来源、表达调控、分子改造、构效关系及应用进行了阐述,指出了今后的研究方向.     

超声波促进蛋白酶联合柠檬酸钠水解剩余污泥蛋白质的探究

本文主要研究超声波对蛋白酶藕合络合剂柠檬酸钠水解剩余污泥中的蛋白质含量的影响.通过凯氏定氮法来测提取液中蛋白质含量和场发射扫描电镜(FESEM)来观察来探究超声波、碱性蛋白酶等方法对剩余污泥中的团聚结构的破坏程度以及使蛋白质产生不同程度的解体.实验结果:超声处理后,协同络合剂柠檬酸钠(SC)与碱性蛋白酶共同对剩余污泥进行水解反应,当反应p H=8,T=50℃,碱性蛋白酶最佳量为60 mg/g,反应2.5 h时提取清液中的蛋白质浓度达到10 059 mg/L.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

蛋白酶对脂肪酶活性影响的研究

为了弄清洗涤剂中碱性蛋白酶及金属离子对碱性脂肪酶稳定性的问题，对加酶洗涤剂中的碱性蛋白酶及金属离子对圆弧青霉ＰＧ３７所产碱性脂肪酶的活力影响进行了研究。在碱性脂肪酶溶液中分别添加不同量的碱性蛋白酶和金属离子，并在２５℃保温３０ｍｉｎ，分别测定保温前后的脂肪酶活力。结果表明：在一定浓度范围内的蛋白酶对ＰＧ３７碱性脂肪酶活力的影响较小，可同时应用于洗涤剂中；金属离子对脂肪酶活力无明显影响，甚至在一定浓度范围内对酶活有激活作用。总之，ＰＧ３７菌株所产碱性脂肪酶具有良好的酶学特性，非常适合于洗涤剂用酶。     

尖吻蝮蛇毒不同蛋白酶水解物的制备及抗氧化活性研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的不同蛋白酶水解产物的制备及抗氧化活性。【方法】分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解尖吻蝮蛇毒,以水解物的水解度、清除自由基活性、金属离子螯合能力和总还原力作为抗氧化活性比较指标来选出最佳水解蛋白酶,并比较该蛋白酶水解物在超滤后得到的不同分子量组分的抗氧化活性大小。【结果】碱性蛋白酶水解物的清除DPPH自由基活性、亚铁离子螯合能力和总还原力均为最佳;该酶解物经超滤得到的3个组分中,分子量为3～10kDa的组分对DPPH自由基和羟基自由基清除能力最强,分子量大于10kDa的组分的亚铁离子螯合能力和总还原力最强。【结论】尖吻蝮蛇毒的不同蛋白酶水解物均具有抗氧化活性,其中用碱性蛋白酶水解物抗氧化活性较强。     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶分离纯化研究

对产白地表茅孢杆菌(B.licheniformis)的碱性蛋白酶通过乙醇沉淀、盐析、DEAE阴离子交换层析,凝胶层析4步纯化.以酶比活力为指标,对碱性蛋白酶分离纯化条件进行了优化.结果发现:提纯酶的比活力达62098U/mg,纯化倍数为23.7,活性回收率为15.7%.     

运动训练对小鼠心肌蛋白酶活性的影响

采用活性电泳方法，研究了运动训练对小鼠心肌蛋白酶活性的影响。结果表明：（1）随着运动强度的增加，不同运动训练组小鼠心肌的中性和碱性蛋白酶活性有不同程度的升高。酸性条件下，未检测到蛋白酶活性；（2）运动心心肌碱性蛋白酶活性的影响比对中性蛋白酶活性的影响更为显。     

基于蛋白包覆金纳米簇的碱性蛋白酶荧光检测

设计开发了一种在碱性条件下由溶菌酶包覆合成并稳定的荧光金纳米簇,并利用它实现对碱性蛋白酶的快速灵敏检测.其检测原理是碱性蛋白酶将包覆和稳定金纳米簇的溶菌酶进行水解,造成金纳米簇的荧光下降.通过关联荧光下降程度与碱性蛋白酶浓度的关系,可实现对碱性蛋白酶的定量检测.考察了金纳米簇与碱性蛋白酶溶液体积比、反应温度和反应时间对检测灵敏性的影响规律.结果表明:在金纳米簇与碱性蛋白酶溶液体积比为1∶9、反应温度为40,℃、反应时间为3,h的条件下,检测效果最好;该检测方法的线性范围可达2~2,000,μg/m L(即酶活检测范围为4×10-5~0.04 unit/m L),检测限为0.1μg/m L(即酶活检测限为2×10-6 unit/m L),且检测的专一性较好,有望应用于实际检测.     

碱性蛋白酶水解豆粕制备ACE抑制肽水解条件的优化

为了寻求高效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽制备方法,在实验室条件下利用碱性蛋白酶水解豆粕生产ACE抑制肽,并采用单因素和多因素实验相结合的方法对酶解条件进行优化.结果发现,适当延长碱性蛋白酶的水解时间和提高p H,可大幅度提高ACE抑制肽的抑制活性.单因素和多因素实验综合结果显示,碱性蛋白酶水解豆粕产生ACE抑制肽的适宜水解条件为:p H为9.0,水解温度为50℃,水解时间为4 h,蛋白酶质量分数(酶质量/底物质量)为2.0%,底物质量浓度为40 g/L,在此条件下制备的ACE抑制肽的抑制率可达到97.97%.     

碱性蛋白酶提取牦牛皮胶原蛋白的工艺研究

为了改变牦牛原料皮传统制革的利用方法,实现其经济效益最大化和利用方式绿色化。文中对牦牛皮的基本组成进行了分析,且通过单因素试验法,并在其基础上设计了正交试验,从效率、资源、能源、经济等方面对碱性蛋白酶提取牦牛皮胶原蛋白的最佳工艺进行了研究。结果表明:牦牛皮中含有丰富的胶原蛋白,占到其干重的74.98%;同时碱性蛋白酶酶解牦牛皮制备胶原蛋白的最佳工艺条件为碱性蛋白酶用量为1.5%、温度36℃、液比1∶35和浸提时间12 h。由此可使碱性蛋白酶提取牦牛皮胶原蛋白的提取率达到68.3%。     

洗涤剂用复合酶组分间配伍性能研究

采用不同的类型的污布,通过去污率评价,研究了已商品化的碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶、淀粉酶这四种酶中二组分、三组分、四组分的配伍性能.试验结果表明每种酶对污垢类型的去除具有选择性,四种酶组分间配伍性能良好,为复合酶的应用及复合酶洗涤剂的配制奠定了基础.     

酶解牦牛乳清蛋白制备ACE抑制肽的工艺研究

目的:乳清蛋白是牦牛乳中的重要成分,其经酶解制备的乳源性ACE抑制肽以安全性高和无副作用等优点在高血压的防治中具有重要的研究和应用价值.本实验研究利用乳清蛋白制备ACE抑制肽的工艺技术.方法:本实验对从耗牛乳中提取的乳清蛋白,分别根据碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶各自的最适pH及温度,采用酶解法制备ACE抑制肽,以ACE抑制活性为指标初步筛选出最佳水解酶,并探究最佳酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的最佳反应条件.结果:碱性蛋白酶为制备ACE抑制肽的最佳水解酶,英最佳反应条件为:pH8.5、温度60℃、E/S为5.5％、水解6h.制备的ACE抑制肽抑制率可达到85.2％.结论:碱性蛋白酶为最佳酶选,用碱性蛋白酶制备的ACE抑制肽体外抑制率较高,符合工业生产要求.这为进一步优化乳清蛋白降血压肽的制备工艺提供依据.     

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯庚酮糖酸－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ合成酶）进行结构与功能的深入研究,尝试了ａｒｏＧ基因在枯草杆菌中的表达。表达载体以ｐＵＢ１１０为骨架,采用了枯草杆菌热激蛋白ｇｒｏＥＳＬ基因的启动子,碱性蛋白酶ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ基因的信号肽和Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶ｃｗｌＨＢ基因的转录终止子,将ａｒｏＧ基因在枯草杆菌ＷＢ６００宿主菌中进行了分泌表达     

紫贻贝多糖酶法制备工艺研究

用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别提取紫贻贝粗多糖,以及木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合酶提紫贻贝粗多糖,木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶提紫贻贝粗多糖。并分析研究加酶量、料液比、pH和温度对紫贻贝提取率的影响。结果显示:木瓜蛋白酶最佳加酶量1%,料液比1:15 g/m L,pH为7,温度为60℃。提取率为6.65%。中性蛋白酶最佳为加酶量2%,料液比1:15 g/m L,pH为7,温度为50℃,提取率为5.52%。碱性蛋白酶最佳加酶量为2%,料液比1:15 g/m L,pH为10,温度为50℃,提取率为6.89%。木瓜蛋白酶与中性蛋白酶两步联合酶提取最佳提取条件为加酶量1%,料液比1:20 g/m L,pH为7,温度为50℃,此条件下提取率为6.86%。木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶两步联合酶提最佳提取条件为加酶量1%,料液比1:20 g/m L,木瓜蛋白酶缓冲液pH为7,碱性蛋白酶缓冲液pH为10,温度为50℃,此条件下提取率为7.27%。