适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较（英文）

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。     

一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法

高质量的蛋白样品制备是进行双向电泳的前提条件.杨树叶片中因含有丰富的多酚、色素、多糖等物质,给蛋白质的提取带来了困难.为了找到一种适合杨树叶片的蛋白质提取方法,以南林895杨为实验材料,采用三氯乙酸-丙酮沉淀法对杨树叶片蛋白质进行提取.对所提取的蛋白分别用考马斯亮蓝染色法和银染法进行检测,得到了良好的双向电泳图谱.     

甘蓝(Brassica oleracea L.)叶片蛋白提取方法的比较

分别用直接提取法、丙酮沉淀法和丙酮三氯乙酸结合沉淀法提取甘蓝叶片蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明,丙酮沉淀法较适合甘蓝叶片蛋白质的提取.本文对影响SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的关键步骤进行了探讨,对凝胶的不同染色方法进行了比较,确立了一套适用于甘蓝叶片蛋白提取、定量、凝胶制备、电泳、染色以及脱色的方法.采用改良后的丙酮沉淀法提取的甘蓝叶片蛋白SDS-PAGE电泳结果显示,其条带清晰,数量多,分辨率高.     

适于双向电泳分析的银杏叶绿体蛋白质提取方法

【目的】获得银杏叶绿体蛋白质的提取方法,在蛋白质水平探讨银杏光合作用对环境的响应机制。【方法】建立一种适合银杏叶绿体蛋白双向电泳分离的实验体系,采用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,并与三氯乙酸(TCA)-丙酮沉降法进行对比分析。【结果】Percoll密度梯度离心法适用于银杏叶绿体的提取,提取的叶绿体平均完整率在85%左右。单向电泳结果显示,与TCA-丙酮沉降法相比,在用Tris-平衡酚抽提法分离的叶绿体蛋白质泳道中,低分子质量蛋白质条带更多、更清晰。进一步的双向电泳结果表明,用Tris-平衡酚抽提法对银杏叶绿体蛋白质进行提取,蛋白质产量更高,图谱清晰,所分离的蛋白点更多,形态更好,条纹影响相对较小。【结论】Tris-平衡酚抽提法可有效地提取高质量的叶绿体蛋白质并进行双向电泳,可用于银杏叶绿体的蛋白质组学分析。     

一种适用于胡杨叶片非变性蛋白质提取的方法

为探索适用于胡杨叶片非变性蛋白质的提取方法,以采自内蒙古额济纳旗天然胡杨林中胡杨成熟叶片为材料,采用咪唑法、Bis-Tris法、Tris-HCl法和新构建的Tris-SSAD法4种非变性蛋白质提取策略,分别用于提取胡杨叶片蛋白质样品;随后进行第一维非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(1~(st)-DE:Native-PAGE)。相比之下,只有Tris-SSAD法获得了清晰、条带数目较多的Native-PAGE图谱,且结合第二维变性凝胶电泳(2~(nd)-DE:SDS-PAGE)可成功分离出较多蛋白质复合体亚基或相互作用蛋白质分子,证明了Tris-SSAD法非变性温和提取特性。研究建立并优化了适用于胡杨叶片的非变性蛋白质提取方法,为后续进一步分析蛋白质与蛋白质相互作用及蛋白质复合体功能提供了实验基础。     

橡胶草叶片蛋白质提取方法的选择及双向电泳体系的优化

目的为了建立起橡胶草叶片组织的蛋白双向电泳体系。方法采用5种不同方法提取橡胶草叶片蛋白,并通过蛋白提取率和单向SDS-PAGE电泳的比较,筛选出改良TCA-丙酮沉淀法、酚-乙酸铵沉淀法、Tris浸提法3种方法进行2-DE电泳。结果表明选择改良TCA-丙酮法为最合适的蛋白质提取方法。为进一步优化体系,比较了不同染色方法、上样量和固相p H梯度预制胶条(IPG)的p H范围对双向电泳结果的影响,电泳结果表明使用17 cm p H 3-10的IPG胶条、上样量为1200μg、考马斯亮蓝染色法能分离得到更多的蛋白点,是橡胶草叶片双向电泳体系的最优条件。结论本研究初步建立了橡胶草叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究橡胶草蛋白质组学提供依据。     

蚯蚓蛋白质组学研究中3种总蛋白提取方法的比较

双向电泳(2-DE)技术在现阶段的蛋白质组学研究当中,由于其价格相对便宜,仪器设备相对简单而被广泛应用.合适的总蛋白质样品制备方法,可以提高双向电泳蛋白点的数目和分辨率以保证蛋白质组信息的完整性,是整个实验的关键.蚯蚓作为土壤污染和土壤生态毒理学研究的重要生物,其总蛋白质提取的方法学研究还不完善.通过对已发表的文献中的蛋白提取方法进行筛选和优化,利用SDS-PAGE电泳和双向电泳的结果,对三氯乙酸-丙酮沉淀法、裂解液法和酚抽提法对蚯蚓总蛋白提取结果进行了评价,建立了适合蚯蚓蛋白质组学研究的总蛋白样品制备方法.     

富含高丰度蛋白的人参果实双向电泳图谱的建立

通过常规的TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法对人参果实蛋白的提取效果,确立了丙酮沉淀法更适合人参果实蛋白的提取.为进一步改善其2-DE分离效果,对丙酮沉淀法提取的总蛋白用Tris-饱和酚提纯,在其2-DE图谱效果有所改善的基础上,又在Tris-饱和酚中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)对丙酮沉淀法提取的总蛋白进行再次提纯,最终得到质量较高的2-DE图谱,其高、低丰度蛋白都得到了较好的分离.     

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理1、3、5d后，用酚法和TCA／丙酮法提取叶的可溶性蛋白，进行双向电泳(2-DE)分析．结果显示：(1)三种缺铁胁迫的可溶性蛋白，在不同的pH范围中2-DE图谱上的比较．使用pH3～10宽范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳分离后利用Z3图象分析软件，可在SDS-PAGE凝胶上检测到450个左右的蛋白点，酸性蛋白占89％．选用pH4～7窄范围、线性(L)的IPG胶条，经电泳后可在SDS-PAGE凝胶上检测到600个左右的蛋白点，其中缺铁诱导上调表达的有29个点，减弱表达的有1个点，诱导特异表达的有5个点．(2)不同方法提取可溶性蛋白的差异．酚法提取的蛋白再溶性好，纯度较高．TCA／丙酮法简单易操作，蛋白损耗少，在2-DE图象上．碱性端显示的蛋白点较多，但此法的缺点是再溶性差，对2-DE成功分离蛋白有影响．     

低温胁迫下克恩氏冬青幼苗叶片差异蛋白质分析

【目的】研究克恩氏冬青叶片应答低温胁迫的蛋白表达情况,探讨克恩氏冬青耐寒的作用机理。【方法】以2年生幼苗为试材,对其进行-8 ℃和-16 ℃低温胁迫处理,运用双向电泳技术(2-DE)结合质谱技术(MALDI-TOF/TOF MS)检测并分析叶片差异表达蛋白,并对差异蛋白进行了生物信息学分析。【结果】在低温胁迫下,克恩氏冬青幼苗叶片中蛋白表达发生了明显变化,胁迫前后发现共有31个显著差异的蛋白质点,经质谱检测及数据库检索,成功鉴定了其中23个差异表达蛋白点。对其中的20个蛋白成功进行了功能分类,主要涉及蛋白质和氨基酸代谢、光合作用、氧化还原平衡、防御作用、碳水化合物代谢、脂类代谢、氮素代谢等生物学过程。【结论】克恩氏冬青应答低温胁迫是多种蛋白质共同作用的结果,主要通过调节多种代谢过程中的相关蛋白表达来发挥作用。     

小鼠肝组织可溶性蛋白质双向电泳条件的建立

研究的主要目的是建立小鼠肝组织可溶性蛋白质组的双向电泳技术,以等点聚焦为第一向,垂直SDS-PAGE为第二向进行双向电泳,并对样品处理方式、蛋白上样量、凝胶浓度和染色方法等关键因素和环节进行了比较研究,通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。采取的方法具有较高的分辨率和重复性,为进一步实验打下良好基础。     

短日照处理诱导油松容器苗针叶差异表达蛋白质的功能分析

【目的】基于蛋白质水平探讨短日照处理调控油松(Pinus tabulaeformis)容器苗基础代谢和抗逆性机理的研究,完善油松容器苗的育苗和造林技术,为短日照处理育苗技术在我国北方地区困难立地造林中推广应用提供理论依据。【方法】以经日照长度为10 h、持续3 周短日照处理的油松容器苗针叶为研究对象,采用改良的酚法提取针叶蛋白。应用双向电泳结合二级质谱分析的蛋白质组学技术,研究短日照处理诱导油松容器苗针叶蛋白质表达的变化,分析差异表达蛋白质的鉴定和功能。【结果】成功获取5个短日照处理诱导表达差异显著的蛋白质,上调表达的是叶绿体放氧增强蛋白1(oxygen-evolving enhancer protein 1, OEE1)(蛋白点404)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(蛋白点539)、延伸因子-Tu(elongation factor-Tu, EF-Tu)(蛋白点654)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase, RCA)(蛋白点681); 下调表达的是磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1, PGK1)(蛋白点641)。这些蛋白质的功能主要涉及光合代谢、糖代谢和胁迫防御。【结论】短日照处理诱导油松容器苗蛋白质差异表达,对油松容器苗的基础代谢和抗逆性产生重要影响。     

巴西橡胶树树皮蛋白质组学分析体系的构建

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种重要的产胶植物,其体内合成和贮存胶乳的地方是乳管系统,而乳管主要分布于树皮中。以10年生巴西橡胶树无性系“热研88-13”为研究对象,采用改进的三氯乙酸(TCA) 丙酮沉淀法提取树皮蛋白,使用17 cm,pH 4~7的IPG胶条进行双向电泳,得到良好的蛋白图谱。PDQuest软件(Bio rad)分析银染后的凝胶,共得到约350个蛋白点。从这些蛋白点中随机选取10个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库对蛋白进行鉴定。结果显示,这些蛋白主要包括两种来源于巴西橡胶树中的重要蛋白,即橡胶小粒子蛋白(Small rubber particle protein)和橡胶树凝集因子(hevein),此外还有一些其他功能和未知功能的蛋白。     

Proteomic comparison of four maize inbred lines with different levels of resistance to Curvularia lunata(Wakker)Boed infection

Protein profiles of leaves in four maize inbred lines with different disease resistance to pathogen Curvularia lunata(Wakker)Boed were studied by two-dimensional electrophoresis(2-DE)and mass spectrometry.Proteins were extracted from the forth leaf of maize seedlings 24 h after fungal inoculation,and fractionated by polyethylene glycol to precipitate the most abundant leaf protein,Rubisco,before gel separation.Protein profiles from 2-DE showed that total numbers of protein spots were increased in all four inbred lines inoculated with C.lunata CX-3 strain compared with the control.The numbers of changed protein spots in abundance were higher in resistant inbred lines than in susceptible ones,which implied that resistant inbred lines were more sensitive than susceptible ones to pathogen infection.Among proteins identified by MALDI-TOF MS,germin-like protein GLP and translation initiation factor eIF-5A were supposed to play important roles in maize resistance against C.lunata infection.     

Proteomic comparison of four maize inbred lines with different levels of resistance to Curvularia lunata （Wakker） Boed infection

Protein profiles of leaves in four maize inbred lines with different disease resistance to pathogen Curvularia lunata(Wakker)Boed were studied by two-dimensional electrophoresis(2-DE)and mass spectrometry.Proteins were extracted from the forth leaf of maize seedlings 24 h after fungal inoculation,and fractionated by polyethylene glycol to precipitate the most abundant leaf protein,Rubisco,before gel separation.Protein profiles from 2-DE showed that total numbers of protein spots were increased in all four inbred lines inoculated with C.lunata CX-3 strain compared with the control.The numbers of changed protein spots in abundance were higher in resistant inbred lines than in susceptible ones,which implied that resistant inbred lines were more sensitive than susceptible ones to pathogen infection.Among proteins identified by MALDI-TOF MS,germin-like protein GLP and translation initiation factor eIF-5A were supposed to play important roles in maize resistance against C.lunata infection.     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

家蚕卵蛋白的 SDS-PAGE 分析(动物科学)

本研究探讨了蛋白质提取方法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件对家蚕卵蛋白分离效果的影响。分别用裂解液提取法、TCA沉淀法、冷丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法制备蛋白质样品,然后进行6%～12%、6%～15%两种梯度胶的SDS-PAGE,获得了不同提取方法和电泳条件下的电泳图谱用以比较家蚕卵蛋白分离效果。结果表明用TCA-丙酮沉淀法除盐,再用含9 mol.L-1尿素、4%CHAPS、1%DTT的裂解液重悬,最适合家蚕卵蛋白提取;6%～12%梯度胶对家蚕卵蛋白的分离较为适宜。利用这一优化方法对家蚕感染微孢子虫的蚕卵和正常蚕卵进行了比较研究,在分子量66 kD和85 kD处找到了与感染微孢子虫相关的蛋白,为进一步进行正常蚕卵和感染微孢子虫蚕卵的蛋白质组学研究奠定了基础。