含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达

目的：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性。方法：设计含PvuⅠ和KpnⅠ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力。用PvuⅠ和KpnⅠ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序。阳性克隆转化BL21(DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性。结果：成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20 ℃、4 ℃、室温25 ℃下10 d保持稳定。 结论：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录 PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法。     

含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达

目的:构建并表达含有SARS冠状病毒RNA片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒.方法:通过克隆大肠杆菌噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因以及SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段,将这些基因连接到载体 pTrc99a上表达,并进行纯化、定量分析、RT-PCR检测和稳定性试验. 结果: 获得病毒样核蛋白颗粒,在37℃稳定性可达到30 d,能抵抗核糖核酸酶降解. 结论: 该病毒样核蛋白颗粒稳定、安全、可靠,可作为SARS冠状病毒RT-PCR检测、定量分析的有效阳性参考品.     

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

内含HCV RNA病毒样颗粒的HCV荧光定量参考品的建立

目的 使用内含HCV RNA病毒样颗粒建立HCV实时荧光定量参考品,以便对实验操作进行严格的质量控制.方法 使用国家一级校准品对内含HCV RNA病毒样颗粒进行含量标定,并稀释制作定量参考品.结果 内含HCV RNA病毒样颗粒的RNA溶液作为HCV RNA荧光定量检测试剂盒的定量参考品,在检测方法上该参考品既可作为定量参考品,又可当作室内质控品,从样品处理开始就可以监控整个实验操作过程,对实验的可靠性提供了有效的保证.结论 内含HCV RNA病毒样颗粒定量参考品的使用使临床上开展核酸扩增技术(NAT)来检测HCV病毒RNA含量定量准确,结果可靠.     

HIV-1基因型耐药检测能力验证考核品的制备和评估

目的制备人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因型耐药检测能力验证考核品,并对其均匀性和稳定性进行评估。方法选取前期检测出的5个HIV-1阳性血浆样本,其中4个具有不同耐药位点,1个对药物敏感,提取HIV-1病毒RNA,经逆转录PCR和巢式PCR获得3 100bp的pol区基因;将目的基因与pMDTM19-T载体连接后进行基因克隆,从阳性菌液中提取回收重组质粒并测序鉴定,最后评估考核品的均匀性和稳定性。结果 5个目的基因扩增测序均成功,与载体连接后得到重组载体V1、V2、V3、V4、V5,梯度退火荧光PCR结果显示考核品退火温度为64.1℃;质粒稀释倍数≤10 000时,各个样本做荧光PCR的Ct值均小于30,因此,将每种质粒稀释10 000倍分装制成考核品;选择浓度不同的3个样本V1、V2和V3分别做均匀性检测,3组Ct值差异均无统计学意义(P>0.05),该考核品均匀性良好;选择V1、V2、V3做稳定性检测,结果显示该考核品至少可以在室温和4℃稳定保存20d,在-20℃和-80℃保存反复冻存5次后浓度均未发生明显变化,表明该考核品稳定性较好。结论本研究中用克隆载体制备的HIV-1基因型耐药检测能力验证考核品均匀性稳定性良好,是一种经济便捷的HIV-1基因型耐药检测考核品制备方法 。     

自制梅毒、丙肝、艾滋病抗体复合质控品的稳定性评价

目的 评价自制多项目复合免疫定性分析(包含梅毒螺旋体抗体,丙型肝炎病毒抗体,艾滋病病毒抗体)质控品的稳定性.方法 用阳性对照稀释法制备的复合质控品在-20℃以下保存及复溶后2～ 8℃保存的稳定性进行评价.结果 自制质控品- 20℃以下保存稳定至少6个月以上,但因复溶后稳定性不佳应分小瓶一日用量分装.结论 自制复合免疫定性质控品-20C以下保存稳定性较好,分小瓶分装复溶后当天使用稳定性良好,基本能满足基层实验室室内质控的要求.     

靶向IgA肾病Gd-B细胞HPV16 L1重组病毒样颗粒基因载体的构建与表达

目的:构建并表达靶向IgA肾病分泌糖基化缺陷IgA1分子B细胞(Gd-B)的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1重组蛋白病毒样颗粒(VLPs)基因载体。方法:PCR定点突变技术构建HPV16L1-PH嵌合基因片段并与pPIC9K载体连接获得重组表达质粒;将上述质粒通过电转化形式转入毕赤酵母GS115,并在甲醇诱导下表达HPV16L1-PH嵌合蛋白;对Ni柱纯化后获得的目的蛋白分别进行SDS-PAGE和LC-MS/MS鉴定;加入解组装及组装缓冲液对目的蛋白进行包装,透射电镜观察病毒样颗粒的结构及形态。结果:纯化后的重组蛋白经SDSPAGE和LC-MS/MS鉴定确定所检测胶点中的蛋白质为与目的蛋白预测值相同。透射电镜分析粒径分布和结构与预测值相同。病毒样颗粒在组装及解组装缓冲液作用下通过电镜可观察到发生组装及解组装。结论:本研究成功获得了靶向IgA肾病患者异常Gd-B细胞的嵌合HPV16L1-PH嵌合蛋白,为IgA肾病下一步实验研究与靶向性治疗奠定了基础。     

基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备及初步鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达制备基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒并进行初步鉴定。方法首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因C-E3-E2-6K-E1克隆入p Fast-Bac~(TM) Dual转移载体中并鉴定;然后将构建正确的重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞后提取重组杆粒并鉴定;再将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒,并利用免疫荧光法(IFA)鉴定其感染Sf9细胞后E2蛋白的表达;最后通过透射电镜(TEM)和Western-Blot鉴定CHIKV病毒样颗粒。结果成功获得了含有CHIKV结构蛋白基因的重组杆状病毒,该重组病毒经过IFA及WB验证在昆虫细胞中能够表达CHIKV的E蛋白,并在电镜下观察到了直径约60~80 nm的CHIKV病毒样颗粒。结论通过杆状病毒表达系统成功表达并获得CHIKV的病毒样颗粒,为CHIKV早期快速检测法的建立奠定基础。     

杆状病毒多基因表达系统介导的轮状病毒样颗粒表达与组装

目的 构建能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组家蚕杆状病毒,并在BmN细胞中进行初步表达.方法 利用MA104细胞繁殖人A组轮状病毒,RT-PCR扩增病毒结构蛋白vp2、vp6、vp7基因,连接至转移载体pFBDM和pUCDM中,同时引入含IE1启动子的绿色荧光蛋白基因利于检测感染和表达量,再分别通过Tn7及Cre-LoxP重组构建重组病毒.为方便检测基因的表达,在VP7的C-末端添加6-组氨酸(6-His)标签,可通过ELISA等方法快速检测目的 基因表达.结果 扩增获得了轮状病毒三个结构蛋白基因,构建了能高效组装轮状病毒样颗粒的重组表达载体,ELISA检测VP7得到了表达,在BmN细胞中观察到病毒样颗粒.结论 成功构建杆状病毒多基因的表达系统,为生产多哑基蛋白复合物,研究大分子结构提供借鉴.     

HSP70腺相关病毒的制备、表达及纯化

目的 构建HSP70腺相关病毒载体,用于肾脏缺血预适应(ischemia preconditioning,IP)中HSP70的作用及机制研究.方法 利用已构建的转染真核表达重组质粒HSP70/pAAV-MCS,用磷酸钙转染法转染AAV-293细胞产生病毒颗粒,用氯仿- PEG8000/NaCl-氯仿的方法纯化病毒,用流式细胞仪检测病毒滴度.结果 AAV-293细胞产生表达绿色荧光蛋白病毒颗粒,经纯化,其获得滴度为2.2×106的病毒液,其感染活性能满足下一步体内外转染实验所需. 结论成功制备HSP70腺相关病毒并进行扩增及纯化,为下一步研究HSP70在肾脏缺血预适应中的作用及其机制打下基础.     

利用家蚕病毒颗粒表达和纯化抗肿瘤药物天冬酰胺酶

目的：通过家蚕病毒颗粒简化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶的生产纯化过程,为抗肿瘤的药物生产提供依据。方法：利用基因重组技术构建pFastdual-polh-da26-asp融合蛋白真核表达载体,利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达融合蛋白,奈氏试剂法检测L-天冬酰胺酶活性。结果： 成功构建了重组表达载体,融合蛋白在家蚕细胞中顺利表达,并检测到L-天冬酰胺酶在家蚕细胞中表达,活性为2 113.52 U/mg。结论：重组病毒颗粒成功表达,且L-天冬酰胺酶具有一定的活性;可以利用家蚕颗粒病毒简化纯化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶。     

病毒载体介导β折叠阻断肽的表达及其对β淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用

目的:通过病毒载体转染体外培养的海马神经元,观察后者表达分泌性的β折叠阻断肽(β-sheet breaker peptide,BSB)的生物活性。方法:采用分子克隆技术构建编码神经营养素4(neurotrophin-4,NT4)信号肽-BSB融合基因的重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated vrius,r AAV)载体,AAV在包装细胞系293细胞中进行包装,蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒,斑点杂交法测定重组病毒滴度。MTT检测及电镜观察BSB的生物学效应。结果:成功构建p SSHG/NT4-BSB质粒载体,纯化后获得滴度为3.6×1012~1.8×1013/m L的病毒颗粒。通过病毒感染培养的神经元分泌表达的BSB有效地抑制了β-淀粉样蛋白(Aβ)的纤维化聚集,明显降低了Aβ在体外的神经元毒性。结论:采用AAV载体介导的BSB短肽的分泌表达在体外培养的海马神经元中显示了良好的生物活性。     

乙肝病毒核心抗原展示载体的原核表达与电镜检测

目的将多克隆酶切位点MCS插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的loop区,构建乙肝病毒核心抗原展示载体。方法将多克隆酶切位点MCS插入到HBcAg的c/e1 loop区,取代了HBcAg c/e1 loop区的Pro79与Ala80氨基酸残基,成功构建了pET28a-HBcAg-MCS原核表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用不同IPTG浓度梯度进行原核诱导表达与NI-NTA亲和层析纯化,利用SDS-PAGE电泳和透射电镜检测。结果成功表达了HBcAg-MCS融合蛋白,且最佳的IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,利用镍柱纯化得到了较纯的HBcAg-MCS融合蛋白,进一步利用负染法透射电子显微镜检测到HBcAg-MCS融合蛋白呈现病毒样颗粒结构。结论 HBcAg-MCS融合蛋白能够自发形成病毒样颗粒结构,为乙肝核心抗原HBcAg作为展示载体的广泛应用打下基础。     

血站核酸定性检测实验室统计学质量控制方法的建立

目的 建立血站实验室8人份PCR混检和TMA单人份三联检两类核酸定性检测系统的室内质控统计学控制方法,用以监测日常检测工作的稳定性。方法 收集2019年1—8月CHITAS12000/ABI7500 PCR核酸扩增系统外部质控品的HIV/HCV/HBV混检检测结果的Ct值和Procleix TIGRIS核酸检测系统外部质控品的HIV/HCV/HBV联检S/CO值。对数据进行正态分布检验,判断是否可以使用基于数据正态分布的统计学质量控制方法。符合正态分布的项目绘制Levey-Jennings质控图,不符合正态分布的项目采用指数加权移动平均(exponential weighted moving average, EWMA)质控图对外部质控品检测S/CO值进行分析。结果 浩源PCR混检系统HIV、HCV和HBV外部质控品混合检测Ct值符合正态分布,利用Levey-Jennings质控图可以监测实验稳定性。TGRISTMA检测系统HIV、HCV和HBV外部质控品联检S/CO值均不符合正态分布。利用EWMA质控图对外部质控品核酸联检S/CO值的波动情况进行监控。结论 利用8人份浩源混检外部质控...     

乙型肝炎病毒DNA定量检测室内质控品的制备与评价

目的自制乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)临界阳性、强阳性和阴性3个水平的室内质控品,对其临床检验实际应用价值进行初步评价。方法收集日常工作中HBV-DNA强阳性、临界阳性和阴性标本,分别混合后分装冷冻于-80℃,按方法学评价进行均一性、重复性、准确性和稳定性研究。结果自制HBV-DNA3个水平室内质控品的均一性、重复性、准确性均达到实验要求;15个月的自制质控品均数(x珋)、标准差(s)、变异系数(CV)差异无统计学意义,稳定性好,符合检测项目质控要求。结论自制HBV-DNA3个水平的质控品具有良好的均一性、重复性、准确性和稳定性,可用于HBV-DNA室内质控。     

含Aβ1-15 的嵌合型HBcAg 颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

目的: 原核表达并纯化含β- 淀粉样肽(β-amyloid peptide, Aβ) 氨基段15 肽(Aβ1-15) 和删除c/e1表位的截断型HBcAg 的融合蛋白,观察其形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease, AD) 基因工程疫苗的研究提供基础。方法:将合成的Aβ1-15 基因连接于HBcAg 的1~71 的3′端,再将HBcAg 的88~144 位氨基酸的基因片断连接于Aβ_1-15 的基因的3′端,构建重组质粒pUC/c-Aβ₁₅-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+) 中,构建表达质粒pET/ c-Aβ₁₅-c。异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) 诱导、SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色检测重组基因的表达。表达的融合蛋白( 命名为CA15C) 纯化后,透射电镜观察病毒样颗粒的形成。以病毒颗粒抗原CA15C 腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA 法检测小鼠血清中抗-Aβ 抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA 序列测定证实,目的基因重组于表达质粒之中,与理论设计相符。诱导表达后,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见表达蛋白CA15C,以沉淀中为多,约占细菌沉淀总蛋白的40%。电镜下可见纯化后的CA15C 形成直径约30 nm 的病毒样颗粒。昆明小鼠经CA15C 免疫5 次后,其血清中抗-Aβ 抗体的滴度可达1:10000,且检测不到抗-HBc 抗体。结论:原核表达制备的含Aβ_1-15 和HBcAg 的融合蛋白CA15C,可形成病毒样颗粒,有较强的免疫原性。     

小鼠nNOS(AA1-133)基因慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建含nNOS(AA1-133)基因的慢病毒载体,检测其表达和功能?方法:采用RT-PCR扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因,构建真核表达载体pIRES2-EGFP/nNOS(AA1-133)?鉴定正确后将目的基因克隆入慢病毒载体pGC-FU,得重组载体pGC-FU/nNOS(AA1-133),采用Lipofectamine 2000将其转染293T细胞,包装慢病毒颗粒后感染原代神经元,检测目的片段的表达和功能?结果:成功扩增小鼠nNOS(AA1-133)基因片段,测序证明重组慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,包装后的慢病毒颗粒可以感染神经元,目的片段可在神经元中表达并与PSD95结合?结论:慢病毒载体pGC-FU/nNOS(AA1-133)构建成功,目的片段在原代神经元中可表达并发挥功能?     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

冷藏和冷冻生化质控品的结果比较分析

目的：比较分析两种保存生化质控品方法的结果。方法：将两种保存方法的质控品上全自动生化分析仪检测。结果：冷藏质控品的所测均值除了TP、ALB、CREA、TG外其他项目均小于冷冻质控品。冷藏质控品的SD、CV％除CA之外其他项目均大于冷冻质控品。结论：冷冻质控品的方法所得数据的SD、CV％相对比冷藏质控品的小,稳定性好,可作为一种理想的保存生化质控品的方法,值得在室内质控时应用。