具有控释性能的可注射牙槽骨修复材料中β-磷酸三钙的体外细胞毒性研究

目的 利用体外细胞培养技术,对具有控释性能的可注射牙槽骨修复材料中β-磷酸三钙的细胞毒性进行研究.方法 采用体外培养的小鼠成纤维细胞(L-929),在培养液中分别添加不同浓度的β-磷酸三钙浸提液(原液及2、4、8、16倍稀释液),于接种后 72 h 通过 MTT 法显色,在酶标仪 490 nm 波长处测定吸光度值,计算相对增殖率(RGR),对β-酸三钙的细胞毒性进行评价.结果 各组的 RGR 值均≥80%,各浓度组之间差异无显著性意义(P>0.05),提示L-929细胞增殖与β-磷酸三钙浸提液的浓度无明显相关,不同浓度浸提液的细胞毒性为0～1级.结论 具有控释性能的可注射牙槽骨修复材料中β-磷酸三钙对细胞的生长和增殖无明显抑制作用,无明显的细胞毒性.     

仿生型α-半水硫酸钙/磷酸八钙/透明质酸钠复合人工骨材料的细胞毒性实验

目的:通过进行体外细胞毒性实验研究,探讨α-半水硫酸钙/磷酸八钙/透明质酸钠(α-CSH/OCP/SH)复合人工材料的体外细胞毒性作用情况。方法:提取并纯化兔骨髓间充质干细胞(BMSCs);制备α-半水硫酸钙/磷酸八钙/透明质酸钠复合人工骨材料的浸提液;分别以培养基、0. 64%苯酚溶液为阴性/阳性对照组,25%、50%、100%浓度的材料浸提液为实验组;分别于第1、3、5、7天观察BMSCs生长状况、检测各组的吸光度(A)、计算细胞相对增殖率(RGR),并对材料的细胞毒性进行分级。结果:各实验组及阴性对照组中兔BMSCs均生长良好,呈典型长梭形;MTT实验结果表明各实验组阳性对照组之间吸光度(A)值的差异均有统计学意义(P<0. 05),且在相应时间节点上25%浓度实验组与50%、100%浓度实验组之间的A值也具有明显统计学差异(P<0. 05)。结论:仿生型α-半水硫酸钙/磷酸八钙/透明质酸钠对兔BMSCs无细胞毒性,且低浓度的材料浸提液对兔BMSCs增殖有利。     

义齿抗菌性能的研究现状

目的 通过载银纳米二氧化钛义齿基托材料体外细胞毒性的测定,初步评价载银纳米二氧化钛的生物安全性.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测载银纳米二氧化钛义齿基托材料(载银纳米二氧化钛浓度30 g/L)100%、50%浸提液培养小鼠成纤维细胞L-929细胞2、4、7 d后吸光度值(OD值),并计算细胞相对增殖率,以6级毒性分类法评级,采用单因素方差分析法对各实验组及对照组的OD值进行统计学分析,显微镜观察细胞的生长状况.结果 实验组各观察期L-929细胞生长良好,形态正常;载银纳米二氧化钛抗菌剂(<30 g/L)的义齿基托的细胞毒级别为0级.结论 载银纳米二氧化钛抗菌剂的义齿基托无细胞毒性.     

颌面部赝复用硅橡胶老化后体外细胞毒性研究

目的 研究颌面部赝复用硅橡胶老化后的体外细胞毒性.方法 以A-2186硅橡胶和液态双组份SEI硅橡胶作为受试材料,根据GB/T3512-2001分别制备24、48、72 h老化试件.以小鼠成纤维细胞(L-929)培养液为浸提介质,参照GB/T16886.5-2003制备相应浓度的浸提液培养L-929细胞.根据试件的老化时间和浸提液的浓度进行实验分组,同时设立阴性和阳性对照.于加入浸提液后的2、4、7 d分别收集细胞,MTT法检测细胞增殖,以测得的吸光度值(D490nm)计算细胞相对增殖率并以此评价受试件的毒性程度.结果 加入浸提液后2、4 d,SEI老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性为2级.加入浸提液后7 d,A.2186老化48 h 100%浓度组及老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性均为2级;SEI老化48 h 50%和100%浓度组及老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性均为2级.除A-2186老化24 h 50%浓度组外(细胞毒性为0级),其余各组细胞毒性评价均为1级.结论 老化48 h后,液态双组份SEI硅橡胶表现出轻微的细胞毒性;老化72 h后,A-2186硅橡胶和液态双组份SEI硅橡胶均有一定的细胞毒性.建议临床使用赝复体的患者定期更换赝复体.     

颌面部赝复用硅橡胶老化后体外细胞毒性研究

目的 研究颌面部赝复用硅橡胶老化后的体外细胞毒性.方法 以A-2186硅橡胶和液态双组份SEI硅橡胶作为受试材料,根据GB/T3512-2001分别制备24、48、72 h老化试件.以小鼠成纤维细胞(L-929)培养液为浸提介质,参照GB/T16886.5-2003制备相应浓度的浸提液培养L-929细胞.根据试件的老化时间和浸提液的浓度进行实验分组,同时设立阴性和阳性对照.于加入浸提液后的2、4、7 d分别收集细胞,MTT法检测细胞增殖,以测得的吸光度值(D490nm)计算细胞相对增殖率并以此评价受试件的毒性程度.结果 加入浸提液后2、4 d,SEI老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性为2级.加入浸提液后7 d,A.2186老化48 h 100%浓度组及老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性均为2级;SEI老化48 h 50%和100%浓度组及老化72 h 50%和100%浓度组的D490nm均较阴性对照组显著降低,评价细胞毒性均为2级.除A-2186老化24 h 50%浓度组外(细胞毒性为0级),其余各组细胞毒性评价均为1级.结论 老化48 h后,液态双组份SEI硅橡胶表现出轻微的细胞毒性;老化72 h后,A-2186硅橡胶和液态双组份SEI硅橡胶均有一定的细胞毒性.建议临床使用赝复体的患者定期更换赝复体.     

聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径支架的细胞毒性研究

目的:探讨聚乳酸-壳聚糖-明胶(PLA-Chitosan-Gelatine)生物复合支架在牙周组织工程应用中的可行性.方法:HE染色和扫描电镜(SEM)观察支架微观结构.四甲基偶氮哇盐(MTT)比色分析法检测支架浸提液(SLL)细胞毒性.实验分为实验组及对照组;在490 nm波长下用酶标仪测定每孔的吸光度值(OD),计算细胞相对增殖率(RGR),根据RGR值进行支架细胞毒性分级.结果:支架纵切面呈多孔网状结构,孔间相互交连,其孔径介于20～200 μm之间,孔径由光滑面向粗糙面递增.实验组中除100%SLL组RGR为96%外,其余各实验组RGR均大于100%.各实验组OD均值与阴性对照组OD均值差异无统计学意义(P＞0.05),实验组和阴性对照组OD值均与阳性对照组OD均值有统计学差异(P＜0.05).结论:PLA-Chitosan-Gelatine支架三维立体递变性孔径和多孔结构能为成纤维细胞提供良好的培养环境,且无细胞毒性,符合生物学材料要求.     

新型医用无镍不锈钢（BIOSSN4）的细胞毒性评价

目的：评价新型医用无镍不锈钢（BIOSSN4）的细胞毒性。方法：将BIOSSN4的浸提液与体外培养的小鼠成纤维细胞L929接触后,进行MTT实验来评定材料的细胞毒性,并与传统的医用316L不锈钢的生物学性能相比较。结果：BIOSSN4对细胞增殖的抑制作用小于316L不锈钢组,统计学分析结果显示：两种金属材料与阴性对照组的吸光度值之间的差异无统计学意义（P〉0.05）,与阳性对照组之间的吸光度值之间的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：BIOSSN4无镍不锈钢具有微弱的细胞毒性,符合临床应用要求,为其应用提供了一定的生物学依据。     

黄曲霉毒素B1致体外人胚肝细胞损伤的研究

目的探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对体外正常人胚肝细胞(L-02细胞)的急性损伤作用。方法 L-02细胞体外培养,随机分为9组,空白对照组(不加其他试剂),溶剂对照组(加入二甲基亚砜),不同浓度AFB1染毒组(分别加入5、10、20、40、80、160、320 mg/L)。细胞培养24 h后观察各组细胞的形态学变化,并应用MTT法检测各组细胞吸光度值(A),计算细胞毒性指数(CI)。结果培养24 h后,镜下观察发现随着AFB1染毒剂量增大,L-02细胞皱缩变形和凋亡逐渐增多,当浓度达到80 mg/L时可见大量漂浮细胞和细胞碎片。各组细胞吸光度值比较差异有统计学意义(P<0.05),80、160、320 mg/L AFB1染毒组的吸光度值均低于空白对照、溶剂对照组(P均<0.05),并且随着AFB1染毒剂量提高,细胞毒性指数逐渐增高。结论 AFB1染毒浓度大于80 mg/L时,对L-02细胞有显著毒性作用。     

PDGF-BB和bFGF对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜(PDL)细胞碱性磷酸酶(ALPase)活性的影响.方法 从第三代开始体外培养人PDL细胞,取4-8代细胞分为空白对照组与实验组,对照组为纯细胞培养液,实验组细胞用0.1,1,10,100 ng/ml的PDGF-BB,1,10,50,100 ng/ml的bFGF,或二者联合,100 ng/mlPDGF-BB 50 ng/ml bFGF或0.1 ng/ml PDGF-BB 1 ng/ml bFGF进行干预.第3天后,人工裂解一半细胞,所有实验组与空白对照组分为细胞裂解液组与培养液组,用酶动力学方法检测ALPase活性(用吸光度值表示).用SPSS V13.0进行统计.结果 第3天PDGF-BB作用的细胞裂解液吸光度峰值位于0.1 ng/ml,细胞培养液吸光度峰值位于1 ng/ml.第3天bFGF作用的细胞裂解液吸光度峰值位于1 ng/ml,细胞培养液吸光度峰值位于10 ng/ml.100 ng/ml PDGF-BB 50 ng/mlbFGF或0.1 ng/ml PDGF-BB 1 ng/ml bFGF的吸光度值也比对照组显著增高,但是联合作用比单独作用意义不显著(P>0.05).结论 PDGF-BB和bFGF均可明显促进PDL细胞碱性磷酸酶活性.     

离心应力下构建组织工程髓核

目的:探讨离心应力对髓核细胞功能表达和组织工程髓核结构的影响.方法:取兔胸腰段椎间盘髓核组织,经胰蛋白酶.Ⅱ型胶原酶消化分离出细胞,在含15%灭活胎牛血清的DMEM/F12培养基中体外扩增至第3代,以3×107/ml的细胞悬液种植于PIGA无纺网支架上.实验组在离心力下培养(实验1组相对离心力为134.16g,实验2组相对离心力为301.86g,每天2次,每次离心20 min),对照组静态培养,每组4个标本,培养4周后取出髓核细胞与支架复合物,行大体标本,扫描电镜,组织学和免疫组织化学染色观察离心应力对组织工程髓核结构及Ⅱ型胶原分泌情况的影响.结果:离心应力下构建的组织工程髓核的厚度和直径大于对照组,细胞外基质明显多于对照组,Ⅱ型胶原免疫组化染色,实验1组阳性染色面积为(14.36±2.82)%,实验2组阳性染色面积为(18.71±2.14)%,对照组为(9.13±1.58)%,实验1组、实验2组与对照组差异有统计学意义(P<0.01),实验2组与实验1组差异有统计学意义(P<0.05).结论:一定范围的离心应力刺激髓核细胞增加Ⅱ型胶原的分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.     

腺病毒介导的基因在人退变髓核细胞的表达

目的 通过对人退变髓核细胞的原代培养，了解其生物学特性，并将绿色荧光蛋白基因转染至细胞内，观察基因在细胞内的表达情况。方法 培养人退变髓核细胞，建立体外髓核细胞培养模型，同时进行细胞活力测定，并用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染至髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果 (1)人退变髓核细胞贴壁及生长的速度均十分缓慢；(2)随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低；(3)转染了绿色荧光蛋白基因的髓核细胞可以持续发出绿色荧光达4周。结论 (1)兔腰椎间盘髓核细胞的生长能力较弱；(2)外源性的基因可以在髓核细胞内得到持续的表达。     

果胶/聚乙烯醇复合水凝胶的生物相容性评价

目的 评价新型人工髓核材料-果胶/聚乙烯醇复合(CoPP)水凝胶的生物相容性.方法 选用NCTC L929小鼠成纤维细胞进行体外急性细胞毒性试验,分为正常组、阴性对照组(聚乙烯醇,PVA)、实验组(CoPP)、阳性对照组(0.64%苯酚),观察细胞生长状态,于培养2、4、7 d测定OD值、计算相对增殖率(RGR).在SD大鼠左、右臀肌内分别植入脱水的CoPP、PVA水凝胶,观察手术切口及一般情况,于术后1、4、12周取材,观察大体标本及其周围炎性细胞、纤维包囊.结果 CoPP组细胞生长良好,RGR均大于75%,PVA组RGR超过80%.细胞毒性小于1级;阳性对照组RGR小于24%、细胞毒性为4～5级.在植入1周时,PVA、CoPP组局部组织的炎性细胞反应为Ⅳ级、未形成完整囊腔:在植入4周时,炎性细胞反应为Ⅰ级、囊腔反应为Ⅳ级;在植入12周时,炎性细胞及囊腔反应均为Ⅰ级.结论 CoPP水凝胶的细胞毒性为0～1级,体内局部组织反应轻,生物相容性良好.     

兔髓核细胞原代培养及其生物学特性的实验研究

目的建立兔髓核组织体外直接分离培养的方法及其相关生物学特性的测定。方法取2周龄健康日本大耳白兔,无菌条件下分离出椎间盘凝胶状髓核组织,直接加入含有20%FBS的DMEM培养液中培养,倒置显微镜下观察原代髓核细胞的形态;细胞爬片培养后进行甲苯胺蓝和番红O染色观察;通过RT-PCR法,免疫组化法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达;MTT法绘制髓核细胞生长曲线。结果髓核细胞甲苯胺蓝和番红O染色显示阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和蛋白聚糖免疫组化荧光检测呈阳性;RT-PCR鉴定发现细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白聚糖mRNA表达阳性;MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符。结论成功建立了髓核组织直接分离培养方法,原代髓核细胞生长状态良好,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据。     

白细胞介素-1β诱导人椎间盘髓核细胞凋亡

目的：探讨人正常椎间盘髓核细胞的培养方法以及白细胞介素-1β（IL-1β）对人椎间盘髓核细胞凋亡的作用。方法：取特发性脊柱侧弯患者腰椎间盘髓核组织,用胰酶、胶原酶序贯消化法消化细胞,并用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化分别检测糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达,分别用20μg/L和200μg/L重组人IL-1β刺激髓核细胞24 h,检测其凋亡率。结果：用酶消化法可成功分离培养人椎间盘髓核细胞,检测所培养细胞可表达糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原,IL-1β20μg/L组中细胞凋亡率（8.46%）和IL-1β200μg/L组（19.00%）分别为空白对照组（2.86%）的2.95倍和6.63倍（P〈0.05）,IL-1β200μg/L组是IL-1β20μg/L组的2.24倍（P〈0.05）。结论：用酶消化法可成功培养人椎间盘髓核细胞,IL-1β可以诱导椎间盘髓核细胞凋亡,并且随着浓度升高凋亡率增加,提示炎症因子IL-1β在退变椎间盘细胞凋亡中起了重要的作用。     

超高相对分子质量聚乙烯纤维的体外细胞毒性

目的:研究新型口腔修复材料超高相对分子质量聚乙烯纤维(Ribbond)的体外细胞毒性。方法:将Rib-bond置于细胞培养液中72h制备出材料浸渍液,用同一培养液稀释为12.5%,25%和50%后,分别加入含L-929细胞悬液的培养液中,阳性对照组为稀释25%的PVC浸渍液,阴性对照组为新鲜细胞培养液。分别培养1d,3d,5d和7d后,采用MTT法观察细胞活性,计算细胞增殖率用于评定各材料的毒性级。结果:Ribbond的3个浓度组除第1d的25%和50%2个浓度组与阴性对照组相比差异有统计学意义外,其余与阴性对照组相比,差异均无统计学意义。第3d、5d、7d,Ribbond12.5%和25%浓度组的A值均高于阳性对照组。Ribbond的细胞毒性为0～1级。结论:Ribbond无明显细胞毒性。     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

肿瘤坏死因子-α作用下椎间盘退变动物模型的建立

目的:制作家兔椎间盘退变（IVDD）的动物模型,研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对髓核组织的影响。方法:取健康成年家兔30只,手术暴露L₂~L₆,L_3/4、L_4/5作为实验组,每个椎间盘髓核注射20 ng/μL TNF-α 15 μL;L_5/6作为对照组,每个椎间盘髓核注射15 μL磷酸缓冲盐溶液;L_2/3作为空白组,不做处理。于术后4周、8周、12周行腰椎X线及磁共振（MRI）检查,每次随机检查10只家兔,检查完后处死并取其髓核组织经行免疫组织化学及原位末端标记检查。结果:术后4~12周,X线见实验组椎间隙高度进行性下降,MRI可见实验组椎间隙T2加权像信号逐渐降低;免疫组织化学及TUNEL显示实验组髓核组织内Ⅰ型胶原及细胞凋亡率随之时间推移逐渐增加,Ⅱ型胶原逐渐减少。对照组和空白组差异无统计学意义（P>0.05）。结论:实验成功建立了TNF-α作用下的IVDD动物模型。TNF-α介导的椎间盘术后椎间隙高度丢失,同时TNF-α可诱导椎间盘髓核细胞退变及凋亡。微量注射器的穿刺作用对髓核细胞的退变及凋亡无明显影响。     

聚肌苷酸-聚胞苷酸对人髓核细胞基质金属蛋白酶-1、13表达的影响

目的 探究聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid,Poly(I:C)]对人髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)-1、13表达的影响.方法 取人椎间盘组织,采用酶消化法分离并体外培养NPC.不同时间不同剂量的Poly(I:C)刺激NPC,利用qPCR和Western blot方法检测MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达情况;siRNA分别沉默TLR-3、RIG-1和MDA-5后,Poly(I:C)刺激NPC,qPCR检测MMP-1、13的mRNA表达情况.结果 分离培养的NPC 5~6 d后,贴壁生长;Poly(I:C)刺激NPC后,MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默TLR-3后,MMP-1、13的mRNA 表达水平受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默RIG-1和MDA-5后,MMP-1、13的mRNA 表达水平不受影响(P>0.05).结论 Poly(I:C)通过TLR-3受体途径促进NPC表达MMP-1、13.     

纳米载银基托树脂的生物相容性评价

目的:研究纳米载银基托树脂的生物相容性,为纳米载银基托树脂的临床应用提供生物学依据.方法:根据中华人民共和国医药行业标准,用分子滤过法检测纳米载银抗菌剂--载银磷酸复盐STR-1质量分数分别为5 g/L和10 g/L的纳米载银基托树脂的细胞毒性,并测定含两种不同质量分数抗菌剂STR-1的基托树脂与抗菌剂粉体STR-1的溶血率.结果:不含抗菌剂的对照组基托树脂、抗菌剂质量分数分别为5 g/L和10 g/L的纳米载银基托树脂对小鼠成纤维细胞L929无毒性作用,细胞培养第2小时及第24小时,对照组和实验组滤膜染色均匀,呈蓝色,染色密度无变化,褪色面积为0 mm²,毒性分级均为0级.抗菌剂粉体STR-1、含5 g/L和10 g/L抗菌剂的载银基托树脂溶血率分别为1.7%,3.5%和3.7%,溶血率均小于国家医药行业标准规定的5%,为无溶血作用.结论:抗菌剂STR-1含量分别为5 g/L和10 g/L的纳米载银基托树脂具有较好的生物相容性,具备了临床应用的前提.     

两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的:观察口腔常用材料氢氧化钙(calcium hydroxide,CH)和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞(embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9)、原代培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf-H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法:诱导人胚胎干细胞(H9)分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果:CH或复合树脂分别作用24 h和48 h(或72 h)之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs(P<0.05),但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异(P>0.05)。结论:对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。