影响核移植后小鼠重构胚存活因素的研究

将不同类型的供体细胞(卵丘细胞、心肌细胞和上皮细胞)的遗传物质注射到去核的MⅡ卵母细胞中,获得各种重构胚胎,以分析对小鼠卵母细胞进行核移植操作获得重构胚过程中的各种影响因素。结果表明,用Gi emas染料将挤出的卵母细胞质染色证实,可以完整地去除MⅡ卵母细胞核。对370个MⅡ卵母细胞进行去核,去核成功率为92.4%,注核成功率为82.1%;给予90 v/mm,80μsec,1次电脉冲刺激,融合率为72.1%;将融合激活后的重组胚转入KSOM培养基中,平均囊胚率达到35.8%。在胚胎重构过程中,出现了核仁显著变大,出现不同数量核仁的现象。通过比较各种重构胚胎体外后续发育,结果卵丘细胞重构胚胎的体外发育率最好。     

细胞松弛素B对水牛体细胞核移植效果的影响

以水牛耳皮成纤维细胞为供体细胞,采用电融合方法,探讨细胞松弛素B(CB)对水牛体细胞核移植效果的影响.体外成熟培养22～24 h的水牛卵母细胞去核后.将经0.1 mg/L Aphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2～9 d的水牛耳皮成纤维细胞注射到卵周隙中再经电融合(100 V/mm,15μs,电脉冲3次)构建核移植重构胚.重构胚经化学激活后(5 μmol/L)离子霉素5 min,2 mmol/L 6-DMAP 3 h)培养,7～9 d评定其胚胎发育能力.结果显示,在含CB(3 mg/L)的融合液中进行电融合后,核移植的融合率、重组胚的存活率、卵裂率和囊胚率与对照组(不含CB)相比均无显著差异(P>0.05);核移植重组胚激活前用含CB(6 mg/L)的培养液培养1 h,其激活后的存活率(97.52%)和体外囊胚发育率(22.09%)均显著地高于未经CB处理的重组胚的存活率(93.87%)和囊胚率(13.25%,P<0.05);重组胚经离子霉素激活5 min后,在6-DMAP+CB中培养3 h的分裂率明显低于放在6-DMAP中培养3 h的分裂率(65.37% vs 78.92%,P<0.05),但囊胚发育率无显著差异(11.19% vs 10.96%,P>0.05).这表明水牛体细胞核移植电融合时,融合液中不添加CB,而核移植重组胚激活前经CB培养处理后,有利于胚胎的进一步发育,但激活后用CB培养处理会降低胚胎的发育率.     

不同去核方法对猪手工克隆重构胚发育效果的影响

为探讨不同去核方法对猪手工克隆(HMC)重构胚发育效果的影响,本研究比较了盲切法,第一极体(Pb1)定位法及脱羰秋水仙碱(DM)辅助去核法3种不同的去核方法的去核效率及HMC胚胎发育的影响。结果表明:第一极体定位法和DM辅助去核法的整体去核效率显著高于盲切法去核法(P0.05);应用0.4μg/m L DM处理卵母细胞60 min的突起率、整体去核效率显著高于其他浓度和时间处理组(P0.05);DM辅助去核与pb1定位去核法2种不同去核方法对HMC重构胚的发育效果的影响差异不显著。本研究表明,添加适量的DM可以提高徒手克隆去核效率,且对后期重构胚发育没有显著影响。     

水牛徒手克隆胚胎培养及冷冻条件的优化

本试验利用微滴、微穴和平板培养系统对徒手克隆(hand-made clone,HMC)重组胚进行体外培养;采用了40% EG(ethylene glycol,EG)、25% EG＋25% DMSO(dimethylsulphoxide,DMSO) 和20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为玻璃化冷冻液对HMC囊胚进行了超低温冷冻;并且比较了HMC与传统核移植的胚胎生产效率及囊胚冷冻存活率。结果表明,微穴系统的卵裂率要显著高于平板系统(P<0.05),极显著高于微滴系统(P<0.01);且微穴系统的囊胚率(40.0%)极显著高于平板(19.8%)和微滴系统(8.3%)(P<0.01)。采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为冷冻保护剂时HMC囊胚存活率极显著高于40% EG(P<0.01);HMC重组胚的融合率和囊胚率均高于传统核移植法(P<0.05;P<0.01),而HMC囊胚的冷冻存活率与传统核移植生产的囊胚没有显著差异。以上结果说明水牛HMC可以替代传统核移植法生产克隆胚胎,微穴体系最适合水牛HMC胚胎的体外培养,且采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖对HMC囊胚进行玻璃化冷冻可以取得良好的冷冻效果。     

体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究

采用成年小鼠的卵丘细胞核、胎儿成纤维细胞作核供体细胞来进行核移植,研究小鼠卵母细胞的去核程序和影响重构胚附植前发育的激活条件;随后将重构胚与供体细胞系共培养后获得囊胚阶段的小鼠重构胚,并将其移植到受体鼠体内后获得了24%克隆胚胎。结果表明,小鼠卵母细胞质能够进行重编程来支持早期的胚胎发育。     

水牛体细胞核移植的研究

系统探讨了水牛体细胞核移植的各种影响因素，并初步建立了水牛体细胞核移植的一整套程序。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞去核后，将经血清饥饿(0.5％FBs)培养2～9d、0．1mg／L Aphidicolin(APD)培养 0．5％FBs培养2～9d或一般培养法(10％FBS)培养的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞，直接注射到去核的卵母细胞质中，或注射到卵周隙中再经电融合(100V／mm，15μs，电脉冲3次)构建重构胚。重构胚经化学激活后(5pmol／L离子霉素5min，2mmol／L6-DMAP3h)培养7～8d，评定其胚胎发育能力。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg／L APD 0．5％FBs培养处理后的重组胚卵裂率，均极显著高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P＜0.01)，但囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1mg／L APD 0.5％FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均无显著差异(63．06％比58．70％，P＞0．05)。以水牛颗粒细胞为核供体时，电融舍法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P＜0.05)，囊胚发育率无显著差异(P＞0.05)。培养3代和6代的水牛颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞，其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P＞0.05)；以这2种细胞不同培养代数作供体进行核移植时，各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异P＞0.05)。这些结果表明：(1)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；(2)0.1mg／L APD预培养处理供体细胞能提高水牛体细胞核移植的效果，但血清饥饿培养则无作用；(3)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞均可作供核细胞，核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚，但前者的效果略优于后者，且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法，但两者的总体效率相似。     

不同蔗糖浓度、供体细胞保存温度和融合温度对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

以昆明小鼠为实验动物,经过超数排卵后得到卵丘卵母细胞复合体(COCs),以卵丘细胞为核供体细胞,卵母细胞为核受体细胞进行核移植,分析比较了不同蔗糖浓度对小鼠卵母细胞去核时间、去核率及重构胚体外发育的影响,并探讨了供体细胞的保存温度和融合温度对重构胚体外发育的影响.结果表明,各蔗糖浓度组的去核率均达到100%,但3%、4...     

不同来源供体细胞及含羞草素对水牛体细胞核移植的影响

本文主要探讨供体细胞类型及含羞草素对水牛体细胞克隆的影响。结果如下:与成纤维细胞相比,卵丘/颗粒细胞可以获得较高的融合率和分裂率,但两者的囊胚率差异不显著;克隆水牛的成纤维细胞能用于核移植,而且对核移植结果没有影响;性别对重构胚的早期发育影响不大;含羞草素处理可以替代血清饥饿处理。     

3种来源猪胚胎激活后6h内基因组DNA甲基化变化模式

主要探讨猪手工克隆(HMC)胚胎和体外受精(IVF)胚胎及孤雌激活(PA)早期胚胎发育过程中6 h内的单细胞核全基因组DNA甲基化模式.运用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光和激光共聚焦显微镜检测相对荧先强度的方法,检测猪手工克隆胚在融合后6 h内全基因组DNA甲基化模式,并与同时期猪体外受精胚及孤雌激活胚胎进行比较,从而探讨这3种胚胎变化模式的异同.结果显示:3种不同来源的胚胎在培养后不同时间点比较时,2、4、6 h均呈强甲基化状态,且均呈下降趋势;在同时间点比较时,2 h和6 h这两个时间点检测到3种胚胎的相对荧光强度均差异不显著(P＞0.05),而在4 h时,HMC胚胎显著高于PA和IVF胚(P＜0.05).结论:猪手工克隆胚在融合后6h内虽然也发生类似IVF胚的全基因组DNA去甲基化,但其去甲基化不充分,甲基化程度偏高,这可能是导致核移植胚胎核重编程不充分、发育能力低的一个原因.     

换液培养对猪卵母细胞的成熟及胚胎体外发育的影响

通过后期去除激素培养比较了卵丘卵母细胞成熟及构建克隆胚后的发育情况,同时孤雌胚胎和体外受精胚胎体外培养48 h后全量换液,比较了其卵裂率和囊胚率之间的差异。结果显示,卵丘卵母细胞培养22h后换成不含激素的成熟培养液继续培养至44 h,其成熟率与对照组无显著差异(P0.05);后期克隆胚胎卵裂率和囊胚率与对照组均无显著差异(P0.05)。孤雌胚胎换液培养卵裂率高于未换液组,囊胚率低于未换液组,但差异均不显著(P0.05)。体外受精胚胎换液培养卵裂率以及囊胚率和未换液组差异不显著(P0.05)。本实验结果说明换液培养对卵母细胞的成熟及后续的体细胞克隆胚发育无显著影响,孤雌和体外受精胚胎换液培养对后期发育也无显著影响。     

水牛体细胞核移植方法比较及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法核移植效果的影响

本研究旨在比较水牛2种体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)方法的效果以及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法(Whole-Cell Intracytoplasmic Microinjection,WCICSI)核移植效果的影响.采用水牛胎儿成纤维细胞作为供核,比较了透明带下注核法(Perivitelline Microinjection,PM)和WCICSI核移植效果.另外,试验了不同类型的供体细胞进行全细胞胞质内注射后与激活前的受体胞质的最适宜作用时间.结果,WCICSI构建核移植重构胚的成功率显著高于PM(87.1%vs 81.1%,P＜0.05),虽然其重构胚的分裂率极显著低于PM(49.5%vs 71.8%,P＜0.01),但囊胚率、核移植的效率无显著差异(P＞0.05).卵丘细胞和胎儿成纤维细胞在注射后3 h激活,重构胚的囊胚发育率最高;颗粒细胞注射后与激活前的最佳时间间隔可在1.5～3 h,但3 h是最佳的作用时间.结果表明,(1)WCICSI可用于水牛体细胞核移植的研究;(2)水牛胞质内注射供体细胞后3 h进行激活,核移植重构胚的发育效果最好.     

不同品种牛卵泡液对水牛卵母细胞体外受精效果的影响

试验利用水牛卵泡液(BuFF)和黄牛卵泡液(BoFF)对不同来源水牛卵母细胞体外受精效果的影响进行了探讨,以完善水牛体外受精培养系统,进一步提高水牛胚胎体外生产效率。试验按成熟培养液中添加卵泡液替代胎牛血清量共分4个组。不添加卵泡液(0%+10%胎牛血清)为Ⅰ组(对照组);添加5%卵泡液+5%胎牛血清为Ⅱ组;添加10%卵泡液+0%胎牛血清为Ⅲ组;添加15%卵泡液+0%胎牛血清为Ⅳ组。结果表明,添加BuFF对活体采集卵母细胞和屠宰场收集卵母细胞的体外受精卵分裂率无显著影响(P0.05),但添加5%和10%BuFF对卵母细胞体外受精后的胚胎发育有明显促进作用,囊胚率均极显著高于对照组和15%BuFF组(P0.01),5%和10%BuFF组间无显著差异(P0.05);添加15%BuFF囊胚率有降低的趋势,但与对照组相比差异不显著(P0.05)。而添加10%BoFF组活体采集卵母细胞体外受精的受精卵分裂率和囊胚率均极显著高于对照组和5%BoFF组(P0.01),添加5%BoFF组的受精卵分裂率和囊胚率与对照组无显著差异(P0.05);添加BoFF对屠宰场收集水牛卵母细胞体外受精卵分裂率无显著差异(P0.05),但添加5%和10%BoFF组的囊胚率均显著高于对照组和15%组(P0.05),添加15%BoFF组与对照组相比,囊胚率显著降低(P0.05),5%和10%BoFF组间囊胚率无显著差异(P0.05)。综合以上结果,在水牛卵母细胞成熟培养液中添加5%～10%的BuFF或BoFF代替牛血清,可明显提高水牛体外胚胎生产效率,且以添加同种的BuFF效果略好。     

水牛卵丘细胞和颗粒细胞单层对卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

[目的]探讨卵丘细胞对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及颗粒细胞单层对水牛体外胚胎发育的影响。[方法]①按卵母细胞有无卵丘细胞情况分为五个组：即自然裸卵组（Ⅰ组）、自然裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅱ组）、人为裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅲ组）、AB级卵母细胞成熟后去除卵丘细胞受精组（Ⅳ组）、AB级卵母细胞对照组（Ⅴ组）分别进行体...     

The Construction of Cloned Sika Deer Embryos (Cervus nippon hortulorum) by Demecolcine Auxiliary Enucleation

The objective of our study was to establish the feasibility of experimental protocols for cloning sika deer. We performed auxiliary enucleation to improve the efficiency of nuclear transfer operation by optimizing the demecolcine concentration to induce cytoplasmic protrusions in the sika deer oocytes. In the present study,we had studied the impact of different demecolcine concentrations on cytoplasmic protrusions and enucleation rates. We determined that 95.9% of the sika deer oocytes formed cytoplasmic protrusions when treated for 1 h with 0.8 μg/ml demecolcine. The lowest observed rate of protrusion was 19.3% after overnight treatment with demecolcine. When the oocytes aged or had a poor cumulus expansion, they exhibited a significant decrease in the ability to form cytoplasmic protrusions. The rates of enucleation (94.9% vs 85.8%, p < 0.05), cell fusion (84.6% vs 70.1%, p < 0.05) and blastocyst formation (15.4% vs 10.9%, p < 0.05) using demecolcine auxiliary enucleation were significantly higher than those after blind enucleation. These results demonstrated that sika deer oocytes could be enucleated quickly and effectively using demecolcine auxiliary enucleation, which could enhance the enucleation rate, cell fusion rate and blastocyst rate of cloned embryos in vitro.     

蒸汽压片玉米对奶牛生产性能和氮磷排放影响的研究

本试验旨在研究蒸汽压片玉米对泌乳早期中国荷斯坦奶牛生产性能和氮磷排放的影响.试验采用4×4重复拉丁方设计.将8头泌乳早期中国荷斯坦奶牛随机分为4组,每组2头.4种日粮处理中蒸汽压片玉米含量分别为精料的0、10%、20%和30%.试验分4期,每期28 d.结果表明:日粮中添加蒸汽压片玉米对奶牛干物质采食量无显著影响(P＞0.05),但显著提高了饲料转化率(奶料比)(P＜0.05);显著提高了奶牛产奶量,其中20%与30%组的4%标准奶产量(FCM)产量分别比对照组提高2.78和2.87 kg·d~(-1)(P＜0.01).对乳成分无显著影响(P＞0.05);乳蛋白、乳糖、乳非脂固形物含量呈增加趋势;对营养物质的表观消化率无显著影响(P＞0.05);日粮中添加蒸汽压片玉米显著降低了乳尿素氮水平(P＜0.05).试验组奶牛氮排放量分别比对照组降低了4.23%(P＞0.05)、9.37%(P＜0.05)和10.29%(P＜0.05),磷排放量分别比对照组降低了1.93%(P＞0.05)、2.59%(P＞0.05)和5.19%(P＞0.05).因此,饲喂蒸汽压片玉米能够有效提高奶牛的生产性能,降低氮磷的排放.     

云南圭山红骨山羊和非红骨山羊肉品质比较研究

试验选用健康、体重相近,全放牧饲养条件下24月龄的云南圭山红骨山羊和非红骨山羊各8头进行屠宰试验,比较两者之间肉品质物理参数、感官品定及肌纤维特性指标,探索红骨山羊肉品质形成的规律及食用品质,旨在为云南山羊的品种改良和云南的肉羊生产提供科学的理论依据。试验结果表明,宰后45 min红骨山羊背最长肌红度值a^*显著高于非红骨山羊(P＜0.05),宰后24 h红骨山羊股二头肌的亮度L^*值和黄度b^*值显著低于非红骨山羊(P＜0.05);红骨山羊背最长肌和股二头肌的剪切力显著高于非红骨山羊(P＜0.05);两种山羊背最长肌的肌纤维直径和密度、熟肉率和失水率差异不显著(P＞0.05);感官品定指标显示红骨山羊膻味评分显著低于非红骨山羊(P＜0.05),总体口感评分显著高于非红骨山羊(P＜0.05);两种山羊的嫩度、多汁性、油腻程度和结缔组织评分结果差异不显著(P＞0.05)。     

手工克隆小鼠胚胎的研究

与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物。小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用。本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松弛素(Cytochalasin B,CB)和链蛋白酶(Pronase)及2%血清的M199 hepes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核,电融合后1 h,重构胚置于含Sr Cl2及CB(5μg/m L)的无钙体外培养液(Ca2+-free IVC)中激活6 h,体外培养液(IVC)中清洗3遍后,移入WOW系统培养,培养至小鼠HMC囊胚阶段。研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20μg/m L和100μg/m L,卵母细胞透明带在10μg/m L组需要更长时间消化至消失,较有利于操作;2)直流电(DC)80 V,持续40μs,融合率达60%。3)含10 mmol/L Sr Cl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比,囊胚更高(29±3%∶13±3%,P0.05),差异显著;4)两种体外培养液,CZB与m PZM,在IVC囊胚率上无显著差异(29±3%∶24±5%,P0.05),而使用CZB可获得较高的囊胚率。本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎,通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液,尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法,并取得了初步成果,技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究。     

饲粮类型和肥育后期不添加维生素和微量矿物元素对猪生长性能、胴体和肌肉品质、粪中矿物元素排泄的影响

本研究共开展两个试验,探讨饲粮类型和不添加维生素和微量矿物元素对猪肥育后期生长性能、胴体和肌肉品质、粪中微量矿物元素排泄的影响。在试验1中,选用128头平均体重(78.5±4.6)kg的肥育猪,根据体重和性别分成4组,每组4圈(重复),每个重复8头猪。四组试验猪的试验处理为2×2因子设计,即两种类型(玉米-豆粕型和玉米-杂粕型)饲粮和添加或不添加维生素/微量矿物元素预混料。在试验2中,选用112头平均体重(90.3±6.3)kg的肥育猪,根据体重和性别分成4组,每组4圈(重复),每个重复7头猪。试验处理同试验1。结果显示,在79~110kg肥育期中(试验1),采食玉米-豆粕型饲粮的猪的增重速度和采食量显著高于采食玉米-杂粕型饲粮的猪(P<0.01或0.05)。在90~105kg肥育期中(试验2),采食玉米-豆粕型饲粮的猪的增重速度仍然高于采食玉米-杂粕型饲粮的猪(P<0.05)。但是,维生素和微量矿物元素添加与否对生长性能无显著影响(P>0.05)。饲粮类型和不添加维生素和微量矿物元素对胴体和肌肉品质均无显著影响(P>0.05)。粪中微量矿物元素含量不受饲粮类型的影响(P>0.05),但不添加维生素和微量矿物元素时,粪中铜、铁、锰的含量显著降低(P<0.01),粪中锌含量也有降低的趋势(P>0.05)。对于生长性能、胴体和肌肉品质以及微量矿物元素排泄量,饲粮类型×维生素/微量矿物元素预混料的交互作用不显著(P>0.05)。结果表明,在猪的肥育后期(最后约25~40d),在玉米-豆粕型和玉米-杂粕型饲粮中可不添加维生素和微量矿物元素,从而可降低饲料成本和减少微量矿物元素的排泄。     

水牛MFSD2A基因多态性及其与产奶性状的关联分析

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间质谱技术对SNP位点进行筛选及基因型检测,并进行遗传多样性、连锁不平衡(LD)和单倍型分析,以及对不同基因型和单倍型与水牛产奶性状进行关联分析。【结果】在水牛MFSD2A基因中检出7个SNPs位点,多态信息含量(PIC)均在0.25~0.40之间,属于中度多态,除g.8290 T＞C位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05);关联分析结果表明,这7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联(P＜0.05),且突变杂合子基因型的305 d产奶量是3种基因型中最低的,g.568 C＞G和g.701 A＞G位点与乳脂率显著关联(P＜0.05),乳脂率从大到小依次为突变纯合子＞野生纯合子＞突变杂合子,g.568 C＞G、g.3326 G＞A、g.8290 T＞C和g.8523 C＞G位点与乳蛋白率显著关联(P＜0.05),7个SNPs位点与乳尿素氮关联均不显著(P＞0.05);连锁不平衡和单倍型分析结果明,g.568 C＞G、g.701 A＞G和g.3203 T＞G位点可组成一个单倍型模块(Block 1),g.8523 C＞G和g.9138 G＞T位点可组成另一个单倍型模块(Block 2)。其中g.568 C＞G和g.701 A＞G、g.568 C＞G和g.3326 G＞A、g.8523 C＞G和g.9138 G＞T位点的r²分别为0.87、0.37和0.48,处于强连锁不平衡状态。Block 1中的H1(CAG)单倍型乳蛋白率显著高于H2(CAT)和H3(GCT)(P＜0.05),Block 2中的D3(GG)单倍型305 d产奶量极显著高于D1(CG)和D2(CT)(P＜0.01)。【结论】筛选出的MFSD2A基因7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联,g.568 C＞G和g.701 A＞G位点与乳脂率显著关联,g.568 C＞G、g.701 A＞G、g.3326 G＞A、g.8290 T＞C和g.8523 C＞G位点与乳蛋白率显著关联,这7个SNPs位点与乳尿素氮均无显著关联。纯合子的基因型在高305 d产奶量和乳脂率的选择上更有优势,H1(CAG)和D3(GG)单倍型是提高水牛305 d产奶量和乳蛋白率的有利单倍型。