Cre/LoxP 系统联合SV40 LTag 诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体（SSR69）转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞;用表达Cre 重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin 在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞（P < 0.05）,在体外培养传代>25 代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异（P > 0.05）,无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag 可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的 利用原代培养的人外阴正常皮肤成纤维细胞,观察中药对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响.方法 胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维细胞;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;测定细胞生长曲线;MTT法测定莪术、黄芪、丹参、川穹及当归5种中药作用后细胞增殖能力.结果 生长曲线测定结果显示:传6代内以及传6代内复苏人外阴皮肤成纤维细胞增殖能力均很强.MTT检测结果显示:5种药物在特定浓度范围内均能抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖.分别作用于人外阴皮肤成纤维细胞72 h后,莪术5、10、100 mg/L浓度组,黄芪500、1 000 mg/L浓度组,丹参1 000 mg/L浓度组,川穹500、1 000 mg/L浓度组,当归100、500、1 000 mg/L浓度组均显示抑制增殖作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中莪术和川穹的抑制强度呈剂量依赖性.结论 成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法;特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖.     

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：研究SV40大T抗原（LT）基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用，以及转化后细胞生物学特性的改变。方法：采用脂质体介导的方法。利用含有LTcDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞。G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达。以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况。结果：分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LTmRNA在转染细胞质中表达。免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达。细胞计数，BrdU，流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡。结论：LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡，所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式。     

人皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

基因治疗方式可分为间接体内法 (ｅｘｖｉｖｏ)和直接体内法(ｉｎｖｉｖｏ)。离体基因治疗方法亦称间接法是将患者的某种组织或细胞取出体外 ,在短期培养的条件下转入目的基因 ,进行筛选和富集整合有外源基因的阳性细胞 ,然后再回输到患者体内。该方法具有靶细胞明确 ,转染效率高的优点 ,因此在基因治疗中被较多采用。目前 ,国际上已有 10余种疾病的基因治疗研究采用皮肤成纤维细胞为靶细胞 ,并且越来越多的研究已进入临床Ⅰ期试验。本实验探讨了人皮肤成纤维细胞的分离及体外培养方法 ,观察总结了体外培养的生长特征 ,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞 ,从而为自体皮肤成纤维细胞基因治疗的研究提供充足、可     

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较。方法酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养。通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力。结果组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprotvs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprotvs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性。结论与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞。     

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的 对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较.方法 酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养.通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力.结果 组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprot vs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprot vs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P＜0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性.结论 与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞.     

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的 建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料.方法 运用脂质体介导的基因转染法将pSV3 neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆并扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合,RT-PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线.结果 阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代,经鉴定SV40T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达.结论 成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系.     

Omega-3多不饱和脂肪酸对角化细胞及成纤维细胞的作用

目的 观察Omega 3多不饱和脂肪酸对人表皮角化细胞增殖和人皮肤成纤维细胞分化的作用.方法 体外培养人表皮角化细胞和人皮肤成纤维细胞,用不同浓度Omega-3多不饱和脂肪酸(EPA)干预角化细胞,BrdU法测角化细胞增殖;不同浓度EPA干预成纤维细胞,ELISA法检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)及人胶原蛋白1的表达;MTT法观察EPA对成纤维细胞活性的影响.结果 EPA浓度在200 μmol/L时,对人表皮角化细胞有明显的促增殖作用,显著提高成纤维细胞培养液中a-SMA的表达,降低人胶原蛋白1的表达.结论 EPA可能通过促进角化细胞增殖、诱导成纤维细胞分化改善伤口愈合.     

脂质体介导的PRX-2转染对人成纤维细胞增殖特性的影响

目的 探讨PRX-2转染对人成纤维细胞增殖特性的影响.方法 取烧伤整形外科手术中所取的全厚皮片的剩余皮片,男5例,女3例.年龄6 ～41岁,平均24岁,均取自腹部.细胞培养采用组织块法,实验用第4代细胞.皮肤组织进行成纤维细胞的培养、传代,利用脂质体介导的基因转染技术,将PRX-2基因转染至人成纤维细胞中,形成稳定表达,利用MTT法、流式细胞仪等方法,观察转染前后人皮肤成纤维细胞增殖特性的变化情况.结果 PRX-2转染后成纤维细胞形态与正常成纤维细胞类似,增殖能力明显增强,G0-G1期细胞比例减少,而S期和G2-M期细胞比例增多.PRX-2基因成功转染到了人成纤维细胞中;细胞增殖指数增高.结论 脂质体介导的同源异形框基因PRX-2转染可以增强人成纤维细胞的增殖能力,PRX-2和人皮肤创面愈合有密切的关系.     

D-二聚体、纤溶酶原激活物抑制物在急性肾衰竭患者血液净化中的临床意义

目的探讨急性肾衰竭（ARF）时D-二聚体（D-D）、纤溶酶原激活物抑制物（PAI）在不同的血液净化方法中的动态变化及临床意义。方法对我院2007年1月—2010年3月急诊住院58例ARF患者血液净化前、净化后4 h及38例健康人进行血浆中D-D含量及PAI水平测定。ARF患者血液净化方法随机采用血液透析（HD）（31例）、血液透析滤过（HDF）（27例）。结果 ARF患者D-D含量及PAI水平较对照组明显升高[D-D（0.83±0.04）与（0.48±0.03）mg/L,P=0.000 2;PAI（14.95±0.73）与（8.03±0.30）103kat/L,P〈0.0001;]HD治疗4 h后D-D含量和PAI活性较治疗前升高[D-D（0.89±0.05）与（1.48±0.37）mg/L,P=0.018;PAI（14.89±1.78）与（22.10±3.56）103kat/L,P=0.025],而HDF治疗后D-D含量和PAI无明显变化[D-D（0.91±0.06）与（1.12±0.09）mg/L,P=0.65;PAI（15.81±1.98）与（16.10±2.56）103kat/L,P=0.86]。结论 ARF患者D-D、PAI水平升高,存在凝血-纤溶系统的紊乱,HD可以加重这种改变,而采用HDF治疗可避免对患者凝血机能的影响,在急性肾衰竭治疗中有一定临床价值。     

五味子乙素逆转膀胱肿瘤多药耐药的实验研究

目的研究五味子乙素对膀胱肿瘤T24/ADM细胞多药耐药的逆转作用。方法 MTT法测定半数抑制浓度IC50和逆转倍数RI,流式细胞仪测定细胞内罗丹明的浓度。结果五味子乙素可以明显增加阿霉素对膀胱肿瘤T24/ADM细胞的细胞毒作用（P〈0.05）,逆转指数为4.11,五味子乙素明显抑制了细胞内罗丹明的外排（P〈0.05）。结论五味子乙素明显抑制了膀胱肿瘤细胞的多药耐药,其机制可能与其抑制P-gp蛋白的外排有关。     

2型糖尿病肾病患者尿微量白蛋白和血清高敏C反应蛋白检测的临床意义

目的观察2型糖尿病肾病（DN）患者24 h尿微量白蛋白（mALB）与血清高超敏C反应蛋白（hs-CRP）的变化及其临床意义。方法将120例2型糖尿病（DM）患者分为：单纯糖尿病组（DM组）40例、早期糖尿病肾病组（EDN组）40例、临床糖尿病肾病组（DN组）和40例健康体检者（正常对照组）40例。结果尿mALB在DN早期即可升高,且随病情发展而进一步升高（P〈0.01）;随着DM尿mALB增加,HbA1c水平逐渐增加（P〈0.05）;DM组血清Hs-CRP水平明显高于对照组,DN组又DM组,EDN组进一步升高（P〈0.01）;DN患者Hs-CRP水平升高与24h尿mALB排泄量呈正相关（r=0.59,P〈0.05）。结论尿mALB和血清Hs-CRP作为两个独立的指标从不同方面反映2型DM患者肾功能的早期损害情况,是诊断2型DM早期肾损伤有价值的实验室指标,值得推广应用。     

急性心肌梗死实验室诊断分析

目的探讨肌红蛋白（Mb）、肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）对急性心肌梗死的诊断应用价值。方法肌红蛋白用免疫比浊法测定;cTnT用BECKMAN Access2化学发光仪测定;CK-MB用贝克曼LX-20全自动生化分析仪测定;然后进行统计学分析。结果 Mb诊断灵敏度在8h达到最高为85%,cTnT灵敏度在24h达99.5%,显著高于Mb的灵敏度,但与CK-MB无明显差异。特异性最高的是CK-MB,在4、8、12、24h的四个时间段平均特异性为98.5%,但与Mb相比差异无统计学意义（P〉0.05）,在各个四个时点Mb阳性预测值明显高于cTnT的阳性预测值（P〈0.01）,但与CK-MB的阳性预测值无明显的差别（P〉0.05）,阴性预测值在4h Mb高于cTnT和CK-MB。结论检测Mb、cTnT、CK-MB的准确性、灵敏度可靠,对急性心肌梗死的早期诊断有重要价值。     

医药信息管理专业开放式实践教学研究及其网络平台建设

在信息管理与信息系统（医药方向）专业开放式实践教学体系研究的基础上,提出了基于专业教学、实践与科研互动的开放式实践教学平台的设计理念,利用动态网站技术构建了开放式实践教学平台,旨在为医药信息管理专业实践教学改革的深化提供有效的途径。     

急性脑梗死患者血清同型半胱氨酸和超敏C反应蛋白检测的临床意义

目的探讨急性脑梗死患者血清同型半胱氨酸（Hcy）和超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平的变化及临床意义。方法应用EliSA法和免疫比浊法对36例急性脑梗死患者进行血清Hcy和hs-CRP水平测定,并与35名正常健康人作比较。结果急性脑梗死患者血清Hcy和hs-CRP水平均非常显著地高于正常人组（P〈0.01）,且血清Hcy水平与hs-CRP水平呈正相关（r=0.5872,P〈0.01）。结论急性脑梗死患者血清Hcy和hs-CRP水平的升高与脑梗死的严重程度呈正相关,可作为预测急性脑梗死发生发展的敏感指标。     

卒中后抑郁与血清单胺氧化酶活性及5-羟色胺水平相关性研究

目的探讨卒中后抑郁与血清单胺氧化酶活性（MAO）及5-羟色胺（5-HT）水平的关系。方法选择卒中患者40例,应用汉密尔顿抑郁量表（HAMD）对照指标量化评分。根据评分分为无抑郁组（Ⅰ）、轻度抑郁组（Ⅱ）、中重度抑郁组（Ⅲ）三组,分别进行血清MAO活性及5-HT水平测定。结果轻度抑郁组血清MAO活性明显高于无抑郁组（P〈0.05）;中重度抑郁组血清MAO活性明显高于无抑郁组（P〈0.05）;轻度抑郁组5-HT水平明显低于无抑郁组（P〈0.05）,中重度抑郁组5-HT水平明显低于无抑郁组和轻度抑郁组（P〈0.05）。卒中后抑郁与血清MAO活性呈正相关（r=0.538,P〈0.05）,与血清5-HT水平呈负相关（r=-0.570,P〈0.05）。结论卒中后抑郁与血清MAO活性呈正相关性,与血清5-HT水平呈负相关性。     

抑郁症患者血浆胃肠激素变化及临床意义

目的 观察抑郁症患者血浆胃肠激素含量的变化及其临床价值.方法 采用放射免疫法分别于治疗前、治疗4周末、治疗8周末对30例住院抑郁症患者（抑郁症组）血浆胃泌素（GAS）、胃动素（MOT）、胆囊收缩素（CCK）含量进行检测,并与30例年龄、性别相匹配的健康者（对照组）相比较.所有抑郁症患者均给予文拉法辛缓释胶囊抗抑郁治疗.结果 抑郁症组治疗前GAS、MOT含量显著低于对照组（P＜0.05）,CCK显著高于对照组（P＜0.05）;治疗4周末、8周末GAS、MOT含量显著高于治疗前水平（P＜0.05）,治疗8周末CCK含量明显低于治疗前水平（P＜0.05）.结论 抑郁症患者存在部分血浆胃肠激素平衡失调,有效的抗抑郁治疗可改善这种失调状态;检测血浆胃肠激素水平可能有助于病情和疗效的判断.     

急性心肌梗死患者急诊PCI前后内皮素、脑钠肽、超敏C反应蛋白水平的变化及意义

目的探讨急性心肌梗死（AMI）患者急诊经皮状动脉介入治疗（PCI）术前后内皮素（ET）、脑钠肽（BNP）、超敏C反应蛋白（hs—CRP）的水平变化及意义。方法根据冠状动脉造影情况,将86例AMI患者分为单支病变组32例、双支病变组30例,三支病变组24例,均成功实施PCI术。所有患者均于PCI术前1h和术后48h检测血清ET、BNP、hs—CRP水平,比较术后与术前水平变化,分析其与疾病程度的相关性。结果各组PCI术后与术前比较,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。双支、三支病变组与单支病变组比较,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。而三支病变组与双支病变组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PCI直接改善了AMI患者的心肌再灌注状态与心功能,术后血浆ET、BNP水平下降,hs—CRP反应性升高,三者水平与冠脉病变程度存在明确的相关性,可以在一定程度上评价AMI患者冠脉病变的严重性与术后改善程度。     

血清脂蛋白（a）检测对早期糖尿病肾病诊断价值的探讨

目的探讨血清脂蛋白（a）[Lipoprotein（a）,LP（a）]测定对临床早期糖尿病肾病（DiabeticBe．phropathy,DN）的意义。方法根据24h尿白蛋白排泄率（UAER）将118例糖尿病患者分为糖尿病无肾病组（A组,4l例,UAER〈30mg／24h）、临床早期DN组（B组,39例,30mg／24h≤UAER〈300mg／24h）及临床DN组（c组,38例,UAER≥300mg／24h）。从同期门诊健康体检者中随机选择40例为对照组（D组）。分别测定各组UAER及血清Lp（a）。各组均数的比较用方差分析,各组分别比较UAER和Lp（a）间的直线相关性。结果糖尿病各组与对照组比较血清Lp（a）升高（A组与D组比P〈0．05,B、C组与D组比P〈0．01）,且随DN之肾脏病变进展（UAER增加）而递增（B组与A组比P〈0．01,C组与B组比P〈0．05）。A组与B组血清Lp（a）水平与UAER呈直线正相关（A组r=0．356,P〈0．05;B组r=0．438,P〈0．01）。结论血清Lp（a）水平与DN肾损害程度相关,可以作为诊断早期DN的辅助方法之一。