苏云金杆菌辅助蛋白基因p19和orf1-orf2对杀虫晶体蛋白CytlAa表达的影响

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P19和0RFl—0RF2对杀虫晶体蛋白CytlAa表达的影响,构建了5个重组表达质粒。5个质粒都含有cytlAa基因,但pT1只含有cytlAa基因,p他同时含有p19基因,pt3同时含有orf1-orf2串联基因,pT4同时含有p19基因和p20基因,pT5同时含有orf1-orf2串联基因和p20基因。将这5个表达质粒和质粒pWF45电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型4Q7中,分别获得转化菌株Bt—T1、Bt—T2、Bt—T3、Bt—T4、Bt—T5和Bt—WF45。SDS—PAGE结果显示,菌株Bt—T1、Bt—T2和Bt—T3只产生少量的27kD cytlAa蛋白,而且部分降解为大约24kD的蛋白。而Bt—T4和Bt—T5能产生大量的cytlAa蛋白,但Bt—T4和Bt—T5的cytlAa蛋白产量都明显少于Bt—WF45。电镜观察和生物测定结果表明Bt—T4和Bt—T5与Bt—WF45的晶体大小和杀蚊毒力没有显性差异。研究表明p19和ORF1—ORF2对CytlAa。蛋白的合成显示可能有抑制作用。     

苏云金杆菌辅助蛋白P19对杀虫晶体蛋白Cry11Aa表达的影响

苏云金杆菌以色列亚种的p19基因、cry11Aa基因和p20基因位于同一操纵子上,据推测辅助蛋白P19可能与Cry11Aa蛋白的晶体化相关。本研究利用穿梭载体pHT3101构建了两个重组质粒pHcy1和pHcy3,两质粒均携带cry11Aa基因,但后者完全缺失了cry11Aa基因上游的p19基因。将重组质粒电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株4Q7中进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明在4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy3)中均能检测到正常表达的Cry11Aa蛋白,但单位体积培养液的Cry11Aa蛋白在辅助蛋白P19存在时的表达量明显高于其单独表达的表达量;透射电镜观察显示两菌株中的Cry11Aa蛋白形成了大小相近、形状相似的双梯形晶体;另外,生物测定结果表明重组菌株4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy3)对三龄致倦库蚊的杀虫活性没有显著性差异。该现象说明辅助蛋白P19的缺失对Cry11Aa蛋白的晶体形成和杀蚊活性没有影响,但P19作为分子伴侣在一定程度上帮助提高了Cry11Aa蛋白的表达水平。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白CrylAb表达的影响

苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C 半端缺少了一段含 4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定 ,报道苏云金杆菌辅助蛋白P2 0帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT310 1构建 3个表达质粒 ,即pT1B、pP1B和pDP1B ,3个质粒都含有cry1Ab基因 ,不同在于pT1B没有p2 0基因 ,pP1B含有p2 0全基因 ,而pDP1B不仅含有p2 0全基因 ,且在p2 0基因前插入cry1A(c)启动子。分别将这 3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中 ,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Westernblot表明cry1Ab基因在这 3株菌中均表达了 130kD的蛋白 ,部分降解为大约 6 0kD的蛋白。蛋白定量分析显示 ,3株菌 130kD蛋白量的比为 1∶1.4∶1 5 ,降解后的 6 0kD蛋白量的比为 1∶1.1∶1.6 ,Cry1Ab蛋白总量的比为 1∶1∶2∶1 6。镜检发现 ,Cry1Ab在 3株菌中都形成典型的菱形晶体 ,其晶体大小为T1B 相似文献   

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定,报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒,即pT1B、pP1B和pDP1B,3个质粒都含有cry1Ab基因,不同在于pT1B没有p20基因,pP1B含有p20全基因,而pDP1B不仅含有p20全基因,且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白,部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示,3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5,降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6,Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现,Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体,其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性,三者的LC₅₀差异不显著。研究表明,P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助,P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

１９８９年Ｈｏｆｔｅ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ根据氨基到序列的同源性和杀虫谱双重标准将苏云金芽胸杆菌杀虫晶体蛋白基因划分为５类１４亚类。根据双重标准出现的问题和冲突,给分类带来了困扰,为此１９９５年,只根据氨基酸序列的同源性进行分类。现已将基因分为２１群,４４亚群,６４类,１１６个亚类。本文介绍了纳入新系统的条件、分类原则、命名方法、定名步骤和分类中值得注意的问题。     

苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

[目的]本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究.[方法]本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力.[结果]经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12.重组表达质粒pET-2Aa在E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白.生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 μg/mL和22.3μg/mL.[结论]菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义.     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

１９８９年Ｈｏｆｔｅ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ根据氨基酸序列的同源性和杀虫谱双重标准将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因划分为５类１４亚类。根据双重标准出现的问题和冲突,给分类带来了困扰,为此１９９５年,只根据氨基酸序列的同源性进行分类。现已将基因分为２１群,４４亚群,６４类,１１６个亚类。本文介绍了纳入新系统的条件、分类原则、命名方法、定名步骤和分类中值得注意的问题。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达

将编码cyt1Aa基因和 p2 0蛋白基因的DNA片段分别克隆连接于两个不同的穿梭载体 pBU 4和pMK 3上 ,构建了重组质粒 pBA 30和 pMA 6,通过电击法 ,将重组质粒分别转化 B .s野生株2 2 97,获得了转化菌株Bs 97 30和Bs 97 6。SDS PAGE和Westernblot分析证实了cyt1Aa基因在转化菌株Bs 97 30中获得了表达 ,而在转化菌株Bs 97 6中未检测到cyt1Aa基因表达的蛋白。转化菌株Bs 97 30中 ,cyt1Aa基因与B .s二元毒素基因同步于菌体生长的对数期起始表达 ,并持续至芽孢形成。生测结果表明 ,转化菌株Bs 97 30中cyt1Aa基因的表达并未明显增强其对敏感和抗性致倦库蚊幼虫的毒力。其原因可能是弱毒性的 cyt1Aa蛋白在转化菌株中的表达量不高。     

苏云金杆菌以色列亚种杀蚊蛋白Cyt1Aa在离中不粘柄菌中的表达

在蚊幼虫生活水域里的离中不粘柄菌(Asticcacaulis excentricus,Ae)中已成功表达苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,Bti)杀蚊蛋白基因cry11Aa的基础上,将另一Bti杀蚊蛋白基因cyt1Aa转化入Ae中表达。构建并转化了分别单独含有cyt1Aa基因、及同时含有cry11Aa基因的表达质粒pSODCyt20和pSODCryCyt20,蛋白免疫杂交检测相应的Ae重组子分别表达产生了Cyt1Aa和Cry11Aa蛋白。为了探究Ae(pSODCryCyt20)重组子不能表达cyt1Aa的原因,提取了重组子总RNA、并与同是革兰氏染色阴性的大肠杆菌的总RNA比较,结果显示两者RNA系统显著不同,推测Ae中多个外源基因的表达,可能要求每个基因必需一个启动子。     

苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建

根据已知序列设计一对PCR引物(ORF5S,ORF3N),可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p19p29的DNA片段,预期大小分别为16kb和20kb。对150株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测,从26株中获得了大小为16kb的扩增片段,但未获得20kb的片段。这表明cry2Aa型操纵子p19p29基因存在较广泛,而cry2Ac型较罕见。将来自Y2菌株的16kb片段回收,通过一系列亚克隆,最终构建成一个含有p19p29串联基因的Bt表达载体,为进一步研究p19p29串联基因的功能奠定了基础。     

对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Aa基因的分离克隆及表达

Bt菌Ly30株是我国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定,它含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法, 设计一对特异引物,分别引入NcoⅠ和BamHⅠ/NcoⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因,与表达载体Pkk233-2相应酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Aa基因重组质粒pKKLy1Aa。完成了该基因的亚克隆和序列测定,结果表明,该基因的编码区为3 531 bp,编码蛋白分子量为133.2kD,含1.176个氨基酸,等电点Pi为4.99。该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为AF384211,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Aa12。对重组菌KKLy1Aa进行诱导表达研究。在0.6 mmol/L IPTG、37℃、8 h培养条件下,该基因获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133.2 kD蛋白带。室内生测结果表明,Cry1Aa蛋白对不同的小菜蛾品系均有较高的杀虫活性,其LC₅₀值分别为0.203 μg/mL和0.554 μg/mL。     

球形芽孢杆菌Mtx1蛋白和苏云金杆菌Cyt1Aa晶体蛋白的协同作用

采用常规的生物测定方法确定了纯化的球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的缺失信号肽的97kDa营养期杀蚊毒素(Mosquitocidal toxin 1,Mtx1)蛋白和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)27.3kDa的Cyt1Aa晶体蛋白对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫的杀虫活性。结果表明Mtx1和Cyt1Aa不同比例的混合物对致倦库蚊的毒力比单独毒素蛋白高,经统计分析表明两毒素蛋白对目标蚊幼虫具有明显的协同作用。在LC98处理浓度下,Mtx1和Cyt1Aa按3∶1混合的混合物LT50值比单独Mtx1的提前了6.36h。表明Cyt1Aa和Mtx1对致倦库蚊具有协同毒杀作用,提高对目标蚊虫的毒力、缩短半致死时间。该结果为深入研究Mtx1和Cyt1Aa的杀蚊作用方式奠定了基础,同时为其在蚊虫防治中的应用提供了新的思路和方法。     

苏云金芽孢杆菌的cry2A芽孢期启动子和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa蛋白表达的影响

【目的】分析苏云金芽孢杆菌的cry2A型芽孢期启动子对晶体蛋白Cry11Aa的协调作用和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa表达的促进功能。【方法】3个包括cry11Aa编码区的重组质粒pHcy1、pHcy2和pHcy4被构建并电激转化到苏云金芽孢杆菌晶体缺陷株4Q7中,其中pHcy1质粒携带cry11Aa基因自身启动子和分子伴侣p19基因,pHcy2携带cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因,pHcy4质粒在pHcy1的上游插入了cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因。SDS-PAGE分析了Cry11Aa蛋白在各重组苏云金菌株中的表达情况,并通过生物测定确定了其对蚊虫的生物活性。【结果】SDS-PAGE结果表明,Cry11Aa蛋白在4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)均获得了表达,在4Q7(pHcy2)中未检测到Cry11Aa蛋白,推测晶体蛋白Cry11A不能利用cry2A型启动子进行表达调控;Cry11Aa蛋白在等体积4Q7(pHcy4)培养液中的表达量是4Q7(pHcy1)菌株的1.25倍,暗示着分子伴侣ORF1-ORF2在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量。4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)形成的Cry11Aa蛋白晶体的形状和大小相似,两者对致倦库蚊的生物活性没有明显差异,LC50s分别为59.33ng/mL和66.21ng/mL。【结论】推测晶体蛋白Cry11A能否成功表达与其使用启动子的类型和两者的协调配合有关。分子伴侣ORF1-ORF2虽然在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量,但对提高Cry11Aa蛋白的杀蚊毒力没有显著性帮助。