山西老陈醋源优良芽孢杆菌菌株的鉴定及筛选

以分离自山西老陈醋醋醅中的9株芽孢杆菌为研究对象,对菌株进行分子生物学鉴定,并对其产酶、产酸、产酯、产多酚和产乙偶姻等发酵特性综合研究。结果表明,9株芽孢菌分别被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CP-18、CP-1853、CP-1671,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CP-803,解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CP-2430,甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）CP-6、CP-1576,漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）CP-15和球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）CP-2436。9株菌的淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶酶活分别为9.77～61.40 U/mL、7.98～54.99 U/mL和4.16～22.80 U/mL,其中菌株CP-1853的蛋白酶活最高（22.80 U/mL）,且具有较高淀粉酶活（43.22 U/mL）和纤维素酶活（38.97 U/mL）;菌株CP-18 和CP-1853产酸和产酯能力较强,分别为0.25 g/L和10.67 g/100 mL;菌株CP-803和CP-1576产多酚和乙偶姻能力较强,分别为596.38 μg/mL和1.15 mg/mL。这些优良菌株可以为山西老陈醋的提质增效起到一定强化作用。     

山西老陈醋中芽孢杆菌的RAPD分型及其与性状之间的关系

从山西老陈醋醋酸发酵过程的醋醅中分离芽孢杆菌(Bacillus),采用分子生物学技术对其进行鉴定,并研究菌株随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)分型和产酶、乙偶姻、多酚、总酯之间的关系,从中筛选一株优良菌株。结果表明,共分离出30株芽孢杆菌,其中11株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、8株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、6株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、2株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、1株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。芽孢杆菌种内具有基因多样性,同种同型别的芽孢杆菌性状具有相似性;但同种不同型别的芽孢杆菌特性具有差异性。最终筛选出1株产糖化酶(89.68 U/m L)、蛋白酶(34.53 U/m L)、乙偶姻(1.05 mg/m L)、多酚(401.36μg/m L)、总酯(9.62 g/100 m L)能力均较强的解淀粉芽孢杆菌38。     

2,3-丁二醇调控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌产物产量的研究

发酵初期在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以调控发酵产物乙偶姻,四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的产量。随着2,3-BD添加量的增加,所产乙偶姻和TTMP的量随之增加,当2,3-BD的添加量≥4.0 g/L时,乙偶姻和TTMP的产量不再增加。同时,枯草芽孢杆菌的生物量、糖转化率也随之变化。该调控方法对枯草芽孢杆菌的分子改造菌株(Δbdh A)调控产乙偶姻和TTMP的产量影响不大。     

山西老陈醋陈酿过程中挥发性香气物质和功能物质的变化规律

对山西老陈醋样品的理化指标、挥发性香气物质及功能物质含量进行测定,并探讨其在不同陈酿时间的变化规律。结果表明,随着陈酿时间在0.5～10年增加,总酸、总酯、氨基酸态氮、氯化钠、还原糖、可溶性固形物、可溶性无盐固形物的含量均呈增长趋势,陈酿10年分别达到11.45 g/100 mL、6.29 g/100 mL、1.17 g/100 mL、1.63 g/100 mL、4.31 g/100 mL、62.00 g/100 mL、53.37 g/100 mL。陈酿样品共检出57种挥发性香气物质,其中酯类含量呈先减少后增加的趋势,酸类含量呈减少趋势,其他类呈增加趋势。陈酿过程中功能物质均呈增长趋势,在陈酿10年最高,总酚、总黄酮、川芎嗪含量分别达到298.62 mg/100 mL、503.62 mg/100 mL、121.79μg/mL。从理化指标、总酚和总黄酮变化来看,陈酿10年最好;从挥发性香气物质、川芎嗪及乙偶姻变化来看,则陈酿5年为宜。     

山西老陈醋中优势产酸菌的分离纯化及功能分析

该研究从山西老陈醋发酵过程中分离纯化得到3株优良产酸菌,分别为巴氏醋杆菌(Acetobactor pasteurianus)BCP0454、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)BCP0738、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BCP0449。从形态学鉴定、分子生物学鉴定等方面对菌株进行鉴定;采用高效液相色谱与气相色谱质谱法对菌株发酵液中所产有机酸和风味物质进行探究。结果表明:BCP0454具有较好产有机酸的能力,并且所产乙酸含量相对较高,达到4885.25 mg/100 mL,产风味物质17种,并且羧酸类和醛类物质含量较高;BCP0738能同时产生乳酸和乙酸,总量为1225.79 mg/100 mL,并且能够产生风味物质23种,其中酯类物质含量最高达到51.70%,并且能产生吡嗪类物质1种;BCP0449能够产2种有机酸,总量达到了2108.24 mg/100 mL,产乙偶姻的含量达到33.55 μg/100 mL,同时能够产生3种吡嗪类物质。     

高效液相色谱法检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量

枯草芽孢杆菌可发酵代谢产生乙偶姻和2,3-丁二醇(两者可逆转化),本研究建立了用高效液相色谱法同时检测发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的方法。对比了不同色谱柱和流动相配比对乙偶姻和2,3-丁二醇含量的测定结果,进一步检测枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量。结果表明:采用Bio-Rad Aminex HPX-87H Column分析;流动相:0.005 mol/L的硫酸溶液;流速:0.5 mL/min;柱温:28℃;示差检测器,在30 min内完成样品检测,乙偶姻和2,3-丁二醇标准曲线相关系数分别为0.9997和0.9998,精密度标准偏差分别为1.76%和1.74%,稳定性标准偏差分别为1.2%和1.6%,回收率为98.93%~102.10%,相对标准偏差≤ 2%。此方法简单准确,检测目标物浓度为50 g/L,检测结果重现性好,发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇含量呈负相关,乙偶姻的含量随着2,3-丁二醇的增加而降低,该方法适合枯草芽孢杆菌发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的发酵检测。     

优良菌株组合发酵对醋醅中川芎嗪及其前体合成的影响

该研究监测山西老陈醋醋酸发酵和熏醅过程中川芎嗪及其前体物质的变化,并对高产乙偶姻及川芎嗪菌株进行筛选及共培养,优选高产菌株组合,在醋醅模拟培养基中添加优良菌株组合联合底物及前体物质,考察其对乙偶姻和川芎嗪生成的影响。结果表明,丙酮酸、2,3-丁二醇和乙偶姻在醋酸发酵阶段呈现上升趋势,在熏醅阶段,2,3-丁二醇和乙偶姻呈下降趋势,丙酮酸含量变化不大;川芎嗪则主要在熏醅阶段生成,从熏醅第2天的6.78 μg/g急剧上升到熏醅第5天的43.52 μg/g。在醋醅模拟培养基中添加莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）B15+甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）B6+丙酮酸组合,川芎嗪生成量最高,达到15.76 μg/g,比对照组提高132.79%。     

山西老陈醋醋醅中产酸菌的分离、鉴定及醇酸耐受分析

以山西老陈醋醋醅为研究对象,从中筛选得到耐醇耐酸的产酸菌。结果表明,从山西老陈醋醋醅中筛选得到7株产酸菌,经鉴定,菌株SAV-1、SAV-2、SAV-5和SAV-9为醋酸菌,菌株SAV-6、SAV-7和SAV-8为乳酸菌。筛选获得3株具有高产酸、高醇酸耐受性的优良菌株,分别为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）SAV-1、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SAV-7和SAV-8。其中菌株SAV-1摇瓶发酵96 h后产酸水平为3.06 g/100 mL,且能够耐受体积分数为13%的乙醇和体积分数为3%的乙酸;菌株SAV-7和SAV-8菌株摇瓶发酵96 h后产酸水平分别为2.05 g/100 mL、1.73 g/100 mL,且均能够耐受9%的乙醇和2%的乙酸,是潜在的食醋生产优良菌株。     

不同陈酿年份市售山西老陈醋理化指标、风味和功能成分的比较

为了比较市售山西老陈醋（SAV）的品质差异,对不同陈酿年份山西老陈醋样品（陈酿1年（SAV1-1～SAV1-3）、陈酿3年（SAV3-1～SAV3-3）、陈酿5年（SAV5-1～SAV5-3）、陈酿6年（SAV6-1～SAV6-3）、陈酿8年（SAV8-1～SAV8-3）、陈酿10年（SAV10-1～SAV10-3））的理化指标、风味及功能物质进行检测。结果表明,陈酿年份越高,山西老陈醋中的pH、总酸、总酯、还原糖、可溶性固形物、氨基酸态氮、有机酸、大部分氨基酸及总多酚、总黄酮、川芎嗪和乙偶姻等功能物质含量越高,陈酿10年SAV的总酸、总酯、还原糖及氨基酸态氮平均含量最高,分别为8.40 g/100 mL、3.64 g/100 mL、3.91 g/100 mL、0.54 g/100 mL,其中有12种氨基酸的平均含量>0.5 mg/mL,SAV10-2样品中有机酸总量最高,为7.02 g/100 mL。总多酚、总黄酮、川芎嗪均在陈酿8年的醋样中平均含量最高,分别为197.96 mg/100 mL、172.04 mg/100 g、96.89 mg/L。     

山西老陈醋醋醅中醋酸菌的分离、ERIC分型及发酵特性研究

通过传统微生物培养分离手段从山西老陈醋醋醅中分离醋酸菌,采用形态学观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并对分离菌株进行肠杆菌基因间保守重复序列（ERIC）分型及发酵特性研究。结果表明,共分离筛选出20株醋酸菌,经鉴定18株为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）,2株为醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）。经ERIC分型,18株巴氏醋杆菌属于5个分型（Ⅰ～Ⅴ型）,2株醋化醋杆菌属于2个分型（Ⅰ和Ⅱ型）。经发酵特性研究,巴氏醋杆菌、醋化醋杆菌中Ⅱ型菌株的温度耐受性均优于Ⅰ型;巴氏醋杆菌Ⅰ型菌株产酸、产乙偶姻能力优于其他型的菌株。在此基础上,筛选出的1株性能优良的菌株,为巴氏醋杆菌SAV-CP 1884,其可耐受高温45 ℃、酒精度10%vol及pH 3,乙酸产量高达9.87 g/L、乙偶姻产量为0.86 mg/mL。     

两种陈酿期山西老陈醋挥发性成分分析

采用同时蒸馏萃取与GC-MS 联用的方法对两种陈酿期的山西老陈醋挥发性成分进行提取与分析。结果共鉴定出29 种成分,主要是酸、酮、酯、醇、酚和杂环类化合物,这些成分经过相互协调和不断熟化,共同形成山西老陈醋特有的风味,其中乙酸、糠醛、3- 羟基-2- 丁酮、丁二酮和四甲基吡嗪的含量较高,大约占总挥发性成分的90%。两种陈酿期山西老陈醋的挥发性成分有一定的差别,这致使五年和八年陈酿期老陈醋的香气不同。并经过调香实验,确认了对山西老陈醋特征香气起主要作用的香成分。     

利用代谢工程构建高产乙偶姻枯草芽孢杆菌

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,在代谢工程育种中,阻断目标产物的降解途径或加强目标产物前体物的代谢通量是有效提高目的产物积累量的重要手段。该研究克隆了来自枯草芽孢杆菌JNA 3-10的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因als S和als D。在大肠杆菌BL21中分别对ALS和ALDC进行表达、纯化和初步的酶学性质研究,随后将ALS、ALDC、ALS+ALDC分别在乙偶姻还原酶敲除菌株(BM)中进行过量表达,发现3株重组菌株的乙偶姻产量与BM菌株相比分别提高了5.2%、4.1%和10.8%,最终乙偶姻产量达到53.5 g/L,生产效率为0.50 g/(L·h)。     

传统山西老陈醋熏醅工艺过程风味物质及功能活性成分的变化

通过对山西老陈醋熏醅过程中理化指标、风味物质及功能活性成分的测定,分析讨论其变化规律。结果表明,熏醅温度呈现上升趋势,水分含量和pH值呈下降趋势,可溶性固形物、还原糖和氨基酸态氮呈现先上升后下降的趋势,总酸和不挥发酸呈现上升趋势。有机酸总量呈现先下降后上升再下降的趋势,于第4天达到最大值3.35 g/100 g。熏醅的挥发性香气成分共检测出64种,其中31种酯类、6种醇类、5种酸类、10种醛类、3种酚类及9种其他物质。多酚呈现先下降后上升的趋势,熏醅第5天最高为533.06 μg/mL;总黄酮、乙偶姻和川芎嗪的含量呈现上升趋势,第5天达到最大值,分别为627.42 μg/mL、1.06 mg/mL、53.64 μg/mL。     

功能菌对曲霉型豆豉风味物质形成的影响

以曲霉型豆豉为研究对象,在生产过程中添加异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)和产酸芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等功能菌,研究其在豆豉发酵过程中对总酸、氨基酸态氮合成的影响,并利用顶空固相微萃取-气质联用法和高效液相色谱法测定成熟豆豉中挥发性物质、有机酸等风味物质,以分析功能菌对有机酸、挥发性风味物质等形成的贡献。结果表明:异常威克汉姆酵母对氨基酸态氮、醇类风味物质的形成贡献巨大,其中氨基酸态氮量超出空白0.188g/100g,醇类的相对含量高达35%;乳酸片球菌对总酸、有机酸和酮类风味物质的形成贡献较大,总酸含量超出空白0.392g/100g,使柠檬酸增加了约8.6倍,琥珀酸增加了约23.5倍,并且生成2,3-丁二酮和乙偶姻风味物质;产酸芽孢杆菌单独添加与异常威克汉姆酵母、乳酸片球菌2种菌复配以及3种功能菌复配对总酸、氨基酸态氮、有机酸的形成均无太大促进作用。     

浓酱兼香型酒醅中产酱香芽孢杆菌的筛选及发酵风味成分分析

该研究从兼香型白酒不同轮次酒醅中筛选到两株碱性蛋白酶活较高并对乙醇具有较好耐受性的菌株,分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S10,其液态发酵产碱性蛋白酶活性分别可达（163.82±15.85） U/mL和（241.69±20.07） U/mL,二者均能在含体积分数6%乙醇的培养基中生长良好。菌株LS9和S10均能产生典型的酱香风味。气质分析结果表明,菌株LS9和S10发酵后代谢产生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亚麻酸等新的风味成分。菌株LS9和S10在小麦固体培养基中均具有一定的发酵产乙偶姻能力,在28 ℃恒温条件下乙偶姻产量分别为（65.15±6.15） mg/L和（41.33±4.82） mg/L,35 ℃→45 ℃→55 ℃升温培养条件下的乙偶姻产量分别为（41.21±3.27） mg/L和（26.91±2.97） mg/L。     

山西老陈醋大曲霉菌生理代谢特征及优良菌株间的互作

对山西老陈醋大曲中分离出的75株霉菌进行形态学及内转录间隔区(ITS)测序鉴定,结果显示黑曲霉和米根霉为大曲中的优势菌属,分别占13%和28%。从75株霉菌中筛选出1株优良产酶菌株——黑曲霉186,其糖化酶、纤维素酶活力分别达到4279.11 U/g和4476.60 U/g。将黑曲霉186与大曲中的优势且高产蛋白酶菌株——米根霉774-2进行共培养,研究二者间的相互作用。结果显示,黑曲霉186与米根霉774-2比例为1∶5时,其蛋白酶、有机酸产量显著高于黑曲霉186纯培养;当比例为1∶0.5时产酯量较纯培养提高了6.07%,挥发性香气成分的种类和含量也显著高于纯培养。综上所述,不同比例下的霉菌组合产酶和产风味物质特性差异较大,找到最优组合菌株比例,将其应用到强化大曲生产中,对提升山西老陈醋的生产效率和产品品质具有重要意义。     

大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析

对茅台酒生产各环节所采集的28个样品进行了初步分析,从高温大曲制作过程的不同环节筛选出芽孢杆菌104株,用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,其中产酱香优良的菌株25株,分为多种香味,与不产香型的细菌对比,产酱香的25株均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等,结合茅台的生产流程分析了其产香的可能机制,得到结论：芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质,进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质。     

功能基因分析辅助筛选产双乙酰和乙偶姻乳酸菌

研究8株分离自内蒙古奶豆腐和西藏灵菇的乳酸菌产双乙酰和乙偶姻特性,通过全基因组注释分析,确定各菌株与双乙酰、乙偶姻等风味物质相关的6个基因。发酵乳双乙酰含量检测显示,嗜热链球菌GST-6、鼠李糖乳杆菌5-1和副干酪乳杆菌N1115的双乙酰产量较高(P0.05),分别为0.72、0.53?μg/mL和0.47?μg/mL;加入柠檬酸后产量为6.23、5.28?μg/mL和4.47?μg/mL。与基因的关联统计分析结果显示,草酰乙酸脱羧酶基因与双乙酰产量高度相关,Pearson相关系数为0.898(P0.01),乳酸脱氢酶基因和乙酰乳酸合成酶基因与产量相关性不显著(P0.05)。乙偶姻产量与6个功能基因的关系不显著(P0.05)。气相色谱-质谱法检测各菌株发酵乳的挥发性化合物组成,共检测到24种挥发性风味化合物,主成分分析显示有机酸、乙偶姻和双乙酰可能是形成菌株特征性风味的主要原因,2-庚酮和2-壬酮对各样品的挥发性风味也有较大贡献。     

山西老陈醋醋酸菌耐热性的研究

为提高山西老陈醋的出率,通过介绍老陈醋生产原理和醋酸菌的特性,对山西老陈醋生产用的醋酸菌进行耐热性研究。通过对菌种进行乙醇氧化筛选和产酸量测定后,筛选出优势菌株,将其在不同温度下培养测得产酸量,从而筛选出5株产酸量高的菌株。其中产酸快的产酸速度>0.04g/dL·h~(-),酒精转化率≥85%,6d产酸>6g/dL;耐高温的菌株在35℃时产酸量达4.964g/dL.     

枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件的优化

为进一步提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液态发酵产凝乳酶(milking-clotting enzyme,MCE)的能力,采用单因素试验和响应曲面法对枯草芽孢杆菌液态发酵的产酶条件进行研究和优化。结果表明：最优发酵工艺为：葡萄糖添加量16.2g/L,在500mL 三角瓶中装53.3mL 料液,接种量为体积分数0.130%,发酵时间120.43h,预测酶活力为1097.30SU/mL,经实验验证,在该条件下发酵产凝乳酶的酶活力为(1129.05 ± 74.55)SU/mL,与模型预测值相符。