人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法。方法采用低速旋转-胰蛋白酶-胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）,采用免疫细胞化学和流式细胞术分析其表型特征,使用含10％FBS低糖-DMEM培养基培养。结果从羊膜分离的hAMSCs数为（6．72±1．21）×10^7/份（n=12）,所分离的kAMSCs明显表达间充质细胞标志物波形蛋白,不表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,高表达CD29和CD44。培养10天hAMSCs数量可增殖167倍。结论建立了人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定方法,hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征。     

人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘,采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养,对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察,用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE,并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状,hAMSCs在培养3-d达到对数增长期,通过流式检测,发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05,未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。     

人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法。方法从足月分娩人胎盘剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用免疫细胞化学、免疫荧光染色及流式细胞术分析其表型特征,使用含表皮生长因子LG—DMEM培养基培养。结果采用低速旋转胰蛋白酶消化法从羊膜分离的hAECs数为（6．13±1．42）×10^7,份（n=12）,所分离的hAECs明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度地表达CD29、CD44和CD71。在表皮生长因子存在的条件下,hAECs生长增殖较快,培养至第6天细胞总数可增殖171倍。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法,hAECs具有上皮细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。     

人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究

目的研究人羊膜间充质干细胞分离培养及免疫调节作用。方法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态学的结构特征及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。建立双向混合淋巴细胞反应体系,根据不同效靶比E/T（hAMSCs/PBMC）加入丝裂霉素处理过的羊膜细胞,用3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。结果从羊膜组织成功培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代,细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入的细胞数量成正比。结论羊膜间充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用。     

人羊膜间充质干细胞的研究进展

人羊膜间充质干细胞(hAMSC)具有来源丰富、分离简单的优点。hAMSC在组织修复中具有支持造血、再生、免疫调节、抗纤维化等作用。本文对羊膜间充质干细胞在各个系统疾病治疗的研究进行了综述,旨在为羊膜间充质干细胞的应用提供参考。     

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

人羊水源性间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 体外分离培养人羊水间充质干细胞(HAFMSCs),观察生物学特性,并鉴定其多向分化能力.方法 采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察细胞增殖能力.FACS检测表面抗原CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,HLA-ABC,HLA-DR等的表达.RT-PCR法分析细胞中OCT-4,Nanog mRNA水平的表达.用成脂、成骨、内皮细胞培养基对HAFMSCs进行诱导,并分别采用油红O,Yon Kossa染色及细胞免疫荧光染色检测其分化能力.结果 羊水细胞于2-3d开始贴壁,10-15d形成细胞集落.传至第3代HAFMSCs呈旋涡状排列,生长曲线呈S形.FACS检测显示CD29,CD44,CD73,CD90,HLA-ABC表达阳性,CD34,CD45,HLA-DR表达阴性,RT-PCR法检测显示HAFMSCs中OCT-4、Nanog mRNA的表达阳性.成脂、成骨诱导21d后油红O、Von Kossa染色阳性,成内皮细胞诱导4周后细胞免疫荧光染色检测vWF抗体表达阳性.结论 成功分离培养出HAFMSCs,细胞具有干细胞特征,具有多向分化潜能.     

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节作用比较

目的 比较人羊膜间充质干细胞(hAMSC)与骨髓间充质干细胞(hBMSC)对异体外周血淋巴细胞的免疫调节功能,为临床应用hAMSC治疗移植物抗宿主病提供实验依据.方法 通过酶消化法和Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分别分离出人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,体外扩增培养间充质干细胞(MSC),获取第4代细胞,建立MSC与经植物血凝素(PHA)刺激的异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用流式细胞术分析比较两种不同共培养体系中T淋巴细胞亚群的变化情况,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子白介素2(IL-2)及白介素10(IL-10)的分泌水平.结果 (1)hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组Treg、Th2、Tc2细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显上升(P<0.05),Th1、Tc1细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显下降(P<0.05),且hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组T细胞亚群的变化差异无统计学意义(P>0.05);(2)ELISA结果提示,与PBMC+PHA组相比,hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-2的水平均明显下降(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-10水平均明显上升(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组上清液中IL-2、IL-10含量的变化无统计学差异(P>0.05).结论 hAMSC、hBMSC对外周血淋巴细胞具有相似的免疫调节功能,提示hAMSC可能为移植物抗宿主病的预防和治疗提供一种新的选择.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定

 目的 探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法，并通过形态学和多向分化能力进行鉴定。方法 抽取人胸椎骨髓标本，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs，体外扩增后传代，相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD13、CD29、HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR。在地塞米松、左旋VitC、b-磷酸甘油、FK506作用下向成骨细胞诱导分化；在TGF-beta 3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱导分化；在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化；在VEGF、bFGF作用下向血管内皮细胞分化。结果 原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。细胞表面标记物CD13、CD29，HLA-2阳性，CD34、CD45 和HLA-DR阴性。经定向诱导分化后，细胞分别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论 该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs，能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞。     

人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

目的探讨人脐带间质干细胞（MSC）的分离、纯化、扩增方法,研究其基本生物学特性.方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞,进行原代培养.应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养.用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志.绘制细胞生长曲线并测定细胞周期.结果两种分离方法均可获得MSC,原代培养12～14 d后可达90%融合,细胞可传代20代以上.流式细胞仪检测结果显示,脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45.结论脐带MSC在体外有较强的增殖能力,可作为组织工程的种子细胞.     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。     

人羊膜间充质干细胞移植后慢性酒精性肝损伤大鼠血生化指标含量的变化

目的有研究表明人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)具有多种分化和增殖功能,其可以诱导分化成肝样细胞,从而对肝损伤有一定的修复作用。方法体外复苏培养人羊膜间充质干细胞,66只健康雌性Wistar大鼠,随机取22只,不做任何处理为正常对照组,余44只采用白酒灌胃30 d的方式建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型,建模后将其随机分为模型组(尾静脉注射1 m L PBS),h AMSCs组(经尾静脉注入1 m L h AMSCs(2×106个),每组各22只。于移植后4周,采用全自动生化分析仪分别检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)、血清白蛋白(ALB)、血清总蛋白(Tp);同时检测检测各组大鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、以及丙二醛(MDA)、IL-4含量变化;免疫荧光显微镜观察PKH-26标记的h AMSCs分布情况,TUNEL法检测各组肝细胞凋亡情况。结果各组大鼠血生化检测结果显示,与正常对照组比较,模型组中ALT、AST、TBIL、Tp含量均显著升高,而与模型组比较,h AMSCs移植组中ALT、AST、TBIL、Tp含量均显著下降(P0.05),与正常对照组比较,模型组中ALB含量明显下降,而与模型组比较,h AMSCs移植组中ALB含量明显升高(P0.05);与模型组比较,h AMSCs移植组SOD、GSH-PX、CAT含量均显著增高,MDA、IL-4含量均显著下降,与正常对照组比较,h AMSCs移植组SOD、GSH-PX、CAT含量均降低,MDA、IL-4含量均升高(P0.05);移植组可见移植的PKH-26标记阳性的h AMSCs细胞分布于肝脏组织内,其余各组未见此类细胞分布(P0.05);TUNEL法检测各组肝细胞凋亡可见凋亡细胞数,模型组最多(34.27±5.71),h AMSCs移植组次之(18.42±3.95),正常对照组未见凋亡细胞。结论人羊膜间充质干细胞移植能够改善大鼠肝硬化的血生化指标水平,h AMSCs移植后可以减轻慢性酒精性肝损伤大鼠的肝脏细胞凋亡。     

不同来源人的间充质干细胞分离与基本生物学特性的研究

目的比较人羊水源性及脐血源性的间充质干细胞(MSCs)分离、培养及其生物学特性,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 用贴壁分离培养的方法分离两种来源的间充质干细胞,观察其形态与生长曲线,并用细胞化学染色的方法测定其生物化学特性.结果 两种来源的标本均可成功分离出MSCs,但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明显强于新生儿脐血源性的MSCs,二者有相似的生物化学特性.结论 孕中期羊水与新生儿脐血来源的MSCs是很好的组织工程种子细胞,新生儿脐血来源的MSCs的增殖能力相对较弱,应用受到一定的限制.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的探讨兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法,比较与人骨髓间充质干细胞表面抗原表达的差异。方法梯度离心法提取兔骨髓中的间充质干细胞,常规贴壁生长,免疫组化和流式细胞的方法检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。结果培养的细胞呈纤维状、克隆样生长;免疫组化表明CD29、CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达,流式细胞的结果表明90.26%的细胞表达CD29,89.76%的细胞表达CD44,仅有5.15%的细胞表达CD34。结论兔骨髓间充质干细胞表面抗原的部分表达与人相同,可用于相关的基础研究。     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

Biological Characteristics of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Cultured in Vitro

Some biological characteristics of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured in vitro were observed, hMSCs were isolated from bone marrow and purified by density gradient eentrifugation method, and then cultured in vitro. The proliferation and growth characteristics of hMSCs were observed in primary and passage culture. MSCs of passage 3 were examined for the purify by positive rate of CD29 and CD44 through flow eytometry. Human bone marrow MSCs showed active proliferation capacity in vitro. The purify of MSCs separated by our method was higher than 90%. It was concluded that hMSCs have been successfully cultured and expanded effectively. It provided a foundation for further investigation and application of MSCs。     

体外分离子宫内膜干细胞3种方法的比较

目的:探索简便、实用、高效的体外分离、培养人子宫内膜干细胞的方法。方法:采用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和混合法3种体外细胞分离方法分离子宫内膜干细胞,并采用相同的方法进行培养。倒置显微镜下观察细胞消化、贴壁时间,纯化情况和细胞生长形态。绘制第2代细胞生长曲线。采用免疫细胞化学法检测第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达,采用RT-PCR法检测CD90和CD146 mRNA的表达。结果:胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞具有操作简便,获得细胞纯度高,细胞易于贴壁,生长良好的优势。胶原酶Ⅰ法分离的细胞经培养后获得的细胞符合正常人子宫内膜干细胞形态学特征和生物学特征;第2代细胞生长曲线均为近似的"S"形;第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达为阳性,CD90和CD146 mRNA有表达。结论:胶原酶Ⅰ法较为简便、实用并具有较高的成功率,是一种培养子宫内膜干细胞的可行性方法。     

人肺来源的间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨来源于人肺的间充质干细胞(MSCs)是否具有免疫调控能力。方法采用流式细胞术鉴定其免疫表型,用淋巴母细胞转化实验观察其是否具有免疫调控能力。结果①MSCs不表达引起免疫反应的细胞表面分子HLA- DR、CD86、CD80等;②随MSCs细胞量增多,抑制T细胞增殖能力越强。结论人肺来源的间充质干细胞具有免疫调控能力。