儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的流式细胞术分析

目的 根据白血病细胞的异常免疫表达,建立流式细胞术检测儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)的方法 ,探讨流式细胞术检测MRD在儿童ALL个体化治疗中的意义.方法 用流式细胞术以多种四色荧光抗体组合对健康儿童骨髓进行检测,建立健康儿童骨髓细胞双参数点图分析模板.对75例ALL初诊患儿的骨髓细胞进行MRD筛选,找出在双参数点图上的位置明显区别于正常骨髓细胞的免疫表型组合作为MRD监测的有效免疫表型组合,对其中60例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本用这些有效免疫表型组合进行MRD监测.同步进行细胞形态学检测和PCR检测29种融合基因、IgH/T淋巴细胞受体(TCR)基因重排.结果流式细胞术检出69例(92.0%)可用于MRD监测的有效免疫表型组合,PCR检出21例(28.0%)可用于MRD监测的融合基因或IgH/TCR基因重排;诱导治疗结束后及后续治疗中有25份骨髓标本细胞形态学未检出白血病残留细胞,流式细胞术检测仍有0.021%～4.130%的白血病残留细胞.结论 流式细胞术检测儿童ALL MRD能较好地评估临床缓解期间ALL患儿体内残留白血病细胞的数量,其覆盖面和速度优于PCR检测方法 ,敏感性高于形态学检测方法 .     

PCR检测急性淋巴细胞白血病微小残留病38例临床分析

微小残留病(Minimal residual disease,MRD)是指白血病患者诱导化疗完全缓解后,体内残留微量白血病细胞的状态.MRD是白血病复发的根源,因此检测MRD对白血病判断预后、预防复发及个体化治疗都有重要意义.作者应用PCR检测了38例急性淋巴细胞白血病(ALL)的IgH和TCRγ基因重排,现报道如下.     

急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及其临床意义

急性淋巴细胞白血病(ALL)完全缓解率已明显提高,缓解期体内残留病灶(MRD)是导致复发而成为影响患者长期生存的主要因素。动态、定量监测ALL缓解期MDR水平具有独立的预后价值,有利于个体化治疗。本文复习了有关ALLMRD检测技术的进展,其中PCR检测白血病特异的DNA/RNA序列,如融合基因和IgH、TCR基因重排,敏感性10~(-4)～10~(-6);流式细胞术分析白血病细胞免疫表型敏感性10~(-4)～10~(-5)。MRD与预后的相关性得到一致肯定,但究竟何时何水平MRD临床价值最大尚需进一步研究确定。     

儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病变检测的意义

急性淋巴细胞白血病(ALL)微量残留病变(MRD)的检测可以确定亚临床水平的疾患。以IgH基因第三互补决定区(CDR-Ⅲ)重排作为克隆特异的基因标记,应用聚合酶链反应(PCR)技术研究MRD,检测水平达到10~4～10~5正常骨髓细胞中1个白血病细胞,超过光学显微镜形态学观察量值的2～3倍。作者对14例复发与缓解的ALL患儿MRD作回顾性比较研究。14例ALL受试患者诊断时年龄1.0～20岁     

应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病

本研究旨在应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD),采用B系ALL18对引物、T系ALL8对引物进行PCR反应扩增Ig/TCR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用SYBR Green I染料法对儿童ALL-MRD水平进行定量。研究结果表明:9例B-ALL患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(marker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD检测发现,其MRD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童ALL MRD标记,SYBR green I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。     

急性淋巴细胞白血病TCR/IgH基因重排的联合检测及临床意义

目的探讨T细胞受体γ（T　cell　receptor．γ，TCRγ）、T细胞受体δ（T cell receptor δ，TCRδ）、免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain H，IgH）基因重排的联合检测方法及其在监测急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）微小残留病（Minimal Residual Disease，MRD）中的临床意义。方法应用PCR／SSP的方法对104例急性淋巴细胞白血病患者（83例儿童、21例成人）进行TCRγ、TCRδ、IgH三种基因重排的联合检测，并通过动态监测来了解它们与临床MPD的关系。结果三种基因重排联合检测在ALL患者的检出率较高（儿童前B-ALL为89．2％，T-ALL为94．4％；成人PreB-ALL为84．6％，T-ALL为87．5％），远高于单一基因重排的检出率；联合检测持续阳性患者的复发率远高与阴性患者（Χ^2=9．07，P〈0．01）。结论TCRγ、TCRγ、IgH基因重排的联合检测方法简便、敏感性高，对于急性淋巴细胞白血病的诊断以及MRD的监测具有非常重要的临床意义。     

多重PCR检测基因抗原受体重排在儿童急性淋巴细胞白血病诊断中的应用

目的 建立多重PCR方法检测免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因重排,探讨在儿童急性淋巴细胞白血病诊断和鉴别中的作用.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和（或）TCR检测方法,对儿童ALL患儿114 例,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRG和TCRB基因重排.结果 在105例B系儿童ALL患者中,克隆重排的检出率分别为IgH 73%、IgK34%、TCRG 44%和TCRB 35%,所有B-ALL患者Ig基因重排检出率可达85%;在11例T系ALL患者中,克隆重排的检出率分别为TCRB 82%和TCRG 73%,T-ALL 患者TCR基因重排检出率可达100%.结论 BIOMED-2引物系统可以检测出绝大多数儿童ALL患者的Ig/TCR基因重排,是一种有效的检测工具,值得在临床中推广使用.     

儿童T-ALL微小残留病的表现特点和两套四色荧光抗体组合的流式细胞术监测方法的探索

本研究旨在探索流式细胞术监测儿童急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)微小残留病(MRD)的方法,并探讨其临床应用价值。运用流式细胞术,以抗TdT/CD5/cCD3/HLA-DR+CD19+CD33和抗CD34/CD5/cCD3/HLA-DR+CD19+CD33两套四色荧光抗体组合检测32例T-ALL初发患儿白血病细胞的免疫表型,同时对照10份正常骨髓标本的检测结果,把能够使白血病细胞在双参数电路图上出现的位置完全不同于正常骨髓细胞的位置的抗体组合作为有效组合,对患儿诱导治疗结束后的骨髓标本进行MRD检测。结果表明,32例T-ALL初治患儿用抗TdT/CD5/cCD3/HLA-DR+CD19+CD33和抗CD34/CD5/cCD3/HLA-DR+CD19+CD33两套荧光抗体各自的有效检出频率为90.6%和62.5%。两套抗体组合联合检测,32例T-ALL患儿都可找到适用的抗体组合进行MRD监测。32例T-ALL患儿诱导治疗缓解后的共计129次的流式细胞术MRD监测阳性率为19.4%(25/129),共检测出15例患儿MRD监测阳性;在监测的同时进行FAB形态学方法检测,阳性率为5.43%(7/129),检测出2例患儿阳性。流式细胞术MRD监测的阳性率明显高于FAB形态学检测的阳性率(P<0.01)。结论:以两套四色荧光抗体组合的流式细胞术能快速有效地对T-ALL进行MRD监测,该方法灵敏度高,对于T-ALL患儿的治疗、预后监测可能有重要意义。     

应用荧光定量PCR检测急性白血病微小残留病的临床意义

对于完全缓解的白血病患者,体内存在的微小残留病（MRD）是复发的主要根源？本实验是通过双链DNA结合SYBR GreenI的实时PCR方法应用免疫球蛋白重链（IgH）和T细胞受体（TCR）基因重排作为ALL微小残留病的检测靶基因,实验证明：MRD可以     

多重PCR法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病患者克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因重排

目的 应用多莺PCR方法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的克隆性免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排,为实时定量RT-PCR(RQ-PCR)法监测ALL患者体内的微量残留病(MRD)奠定基础.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和(或)TCR检测方法,设计96条不同的PCR引物,分成14个混合管,通过多重PCR,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRB、TCRG、TCRD克隆性基因重排.结果 在22例成人B系ALL患者中,Ig克隆性重排检出率为96%,其中IgH为86%,IgK为14%.在18例成人T系ALL患者中,TCR克隆性重排检出率为100%,其中TCRB为83%,TCRG为78%,TCRD为39%.两个及两个以上克隆性标志物的检出率在B和T系ALL中分别为91%(22例中20例)和89%(18例中16例).结论 BIOMED-2协作组设计的14管多重PCR引物和方法,几乎可检测到淋巴细胞白血病患者体内所有占优势的克隆性T、B细胞增殖群体,方法简便、可靠、覆盖面广,适用于成人ALL患者基因重排检测和MRD监测.     

流式细胞术检测儿童B细胞急性淋巴细胞白血病微小残留病

目的建立流式细胞术检测白血病微小残留病(minimal residue disease，MRD)的方法，初步探讨其临床价值。方法用多种四色荧光抗体组合对患儿初发时的白血病细胞进行检测，同时对照多份正常骨髓标本的检测结果，以能够使白血病细胞在双参数点图上出现的位置完全不同于正常骨髓细胞的位置的抗体组合作为有效组合，以这些有效抗体组合对患诱导治疗结束后的骨髓标本进行监测。对58例B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿初诊时的骨髓标本进行了抗体组合有效性的筛选，并对其中的30例患儿诱导治疗结束后的骨髓细胞进行了监测。结果有52例(89．7％)B-ALL患儿都可找到适用于MRD检测的抗体组合。四色组合由CD10／CD34/CD39外加一个有效标志如CD38、CD65、CD66c、CD21等组成。该方法的敏感度为0．01％，远高于形态学检测法。实验中8例患儿诱导治疗结束后的骨髓细胞形态学检测未见白血病残留细胞，但该方法检测结果白血病残留细胞分别为0．028％，1．430％，3．050％，0．015％，5．660％，2．700％，，0．027％和0．069％。结论流式细胞术检测MRD能提高对临床缓解期间患体内残存白血病细胞数量的评估能力。     

三染色-流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微量残留病的研究

目的 建立三染色－流式细胞术检测微量残留白血病细胞。方法 利用三染色－流式细胞仪检测急性B淋巴细胞白血病患独骨髓中的CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型白血病细胞。结果 在23例急性B淋巴细胞白血病患儿骨髓中均可检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞,检测敏感度约为10^－4。正常人骨髓、化疗后再和髓和长期完全缓解的白血病患儿的未检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞。该法可在化疗后50d内监测到白血病细胞的变化,并且在骨髓细胞形态学确认复发之前即可检测到白血病细胞逐渐增加。结论 利用三染色－流式细胞仪检测骨髓中的CD10^ CD22^_CD45^-或dim表现型白血病细胞可以敏感地监测到急性B淋巴细胞白血病患儿微量残留病的变化。     

Detection of minimal residual disease in peripheral blood prior to clinical relapse of childhood acute lymphoblastic leukaemia using PCR

Submicroscopic evidence of persistent minimal residual disease (MRD) in first remission bone marrow samples from children with acute lymphoblastic leukaemia (ALL) indicates a high risk of clinical relapse. Since microscopic evidence of leukaemic lymphoblasts is often present in the peripheral blood in the weeks before clinical presentation at diagnosis or relapse, peripheral blood may be used instead of bone marrow to detect MRD in ALL patients. We examined a median of 0.165 microg (from 1.0-2.0x10(4)cells) genomic DNA from archived peripheral blood smears collected 8-16 months prior to clinical relapse in eight children with ALL for evidence of MRD. We used the polymerase chain reaction and primers designed to identify clonal antigen receptor gene rearrangements. Among the seven patients with bone marrow relapse, MRD was detected at a median of 1.2 months (0-8 months) prior to clinical relapse, indicating that MRD in the peripheral blood may be a late event in the course of leukaemic relapse. A prospective MRD study in ALL patients analysing larger numbers of peripheral blood cells will be needed to evaluate the utility of peripheral blood over bone marrow for MRD testing in childhood ALL.     

成人急性T淋巴细胞白血病T淋巴细胞受体β链基因重排的特点及其在微小残留病定量检测中的意义

目的 建立以TCR β基因重排为分子标志,基于ASO引物的RQ-PCR方法,检测成人T-ALL患者的TCR β基因重排,以利于动态监测患者的MRD.方法 20例成人T-ALL患者的初诊DNA标本经多重PCR检测方法设计38条引物,分成3管,分别扩增TCR β基因完全重排和不完全重排,克隆产物经电泳和双色基因扫描鉴定.对其中4例患者进行基因测序和序列比对分析,根据克隆特异性序列信息,利用软件设计4条ASO引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的Jβ下游引物和TaqMan探针,对患者的随访标本定量监测MRD.结果 20例患者中有17例可检测到克隆性TCR β基因重排,克隆检出率为85.0%(17/20).其中16例可检测到至少1个Vβ-Jβ完全重排(94.1%,16/17),7例患者有Dβ-Jβ的不完全重排(41.2%,7/17),完全Vβ-Jβ和不完全Dβ-Jβ重排之间的比例约为2∶1.双色基因扫描分析显示Jβ2家族的使用频率为73%,Jβ1家族的使用频率为27%,Jβ2家族的使用频率明显高于Jβ1家族.4例患者使用ASO引物RQ-PCR扩增TCR β重排靶基因的标准曲线的斜率为-3.60～-3.27,相关系数＞0.99,敏感性达4×10-5μg/μl,荧光背景信号不显示或较低.监测4例T-ALL患者在疾病治疗各随访时间点的TCR β重排靶基因水平,包括诱导完全缓解、巩固治疗等时间点,RQ-PCR显示其MRD水平随病情的缓解呈逐渐下降的趋势.结论 以克隆性TCR β基因重排为靶分子的特异性寡核苷酸引物RQ-PCR方法可对T淋巴细胞系统的恶性克隆进行准确定量,适用于成人T-ALL患者MRD的随访监测.     

实时定量PCR检测IgH基因重排在成人B系急性淋巴细胞白血病微量残留病监测中的意义

目的 应用实时定量PCR(RQ-PCR)方法 检测患者的免疫球蛋白重链(IgH)基因重排,探讨其在成人B系急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的微量残留病(MRD)动态监测中的意义.方法 15例B系ALL患者的初诊DNA标本经PCR扩增莺排的IgH基因,克隆产物经基因测序、序列比对后,根据每例患者的克隆特异性序列信息,利用软件设计15条等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的JH下游引物和TaqMan探针,监测患者随访标本MRD靶分子.7例Ph+患者同时用RQ-PCR检测bcr-abl融合基因转录本.结果 使用ASO引物RQ-PCR法扩增15例患者IgH重排靶基因的敏感性为10-3～10-5,荧光背景信号未显示或较低.动态监测表明:高危组患者诱导完全缓解(CR)后体内MRD水平明显高于标危组患者,诱导CR后MRD>10-3的患者复发率(71.4%)高于MRD≤10-3的患者(12.5%),MRD>10-3的患者生存时间短.另外,Ph+患者bcr-abl融合基因转录本的对数级变化趋势与IgH重排靶基因水平的动态变化一致.结论 使用ASO引物RQ-PCR方法 检测IgH基因重排,具有敏感性高、特异性强、结果 可靠等优点,可对肿瘤克隆进行准确定量.B系ALL患者体内IgH基因重排水平与临床治疗反应和疾病预后密切相关,可用于患者病情的随访监测.     

CD10在儿童期B-急性淋巴细胞白血病中的表达特点及其在微小残留病检测中的意义

本研究的目的是观察CDl0在儿童期B急性淋巴细胞白血病(BALL)中的表达情况，并探讨CDl0在白血病微小残留病检测中的应用价值。用流式细胞术分析58例儿童期急性淋巴细胞白血病表型，观察CDl0在BALL病例骨髓细胞中的表达特点，并将CDl0抗体与其它多种抗体构成四色组合用于B-ALL的微小残留病检测，评价其所起到的作用。结果表明，65、5％(38／58)的BALL具有CDl0过强表达(CDl0^bright)的特点，而且CDl0^bright与CD34的阳性表达率有关——CDl0^bright多出现于CD34阳性率高的B-ALL中。CDl0^bright在微小残留病检测中，与其它异常表达的抗原形成的组合能够在双参数点图上很好地区分出白血病细胞群与正常细胞群。即使在其他抗原表达无异常时，也可因CDl0的过强表达而使白血病细胞群与正常细胞群区分开。结论：CDl0^bright与BALL中CD34的高比例表达相关，CDl0^bright也是微小残留病检测的一个很好的指标，CDl0的表达与其他用于微小残留病检测的抗原表达的应用有互补作用。