鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列(AY228555),运用Primer Premier 5.0设计2对引物,建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法,采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示,套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍;表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭圆环病毒(DuCV)感染的临床诊断和流行病学调查。     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。     

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。     

新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用

根据基因库中新城疫病毒(Newcastle diseases virus,NDV)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的基因序列,分别设计了2对针对NDV和DPV保守基因序列的引物。用这2对引物对同一样品中的NDV和DPV模板进行二重PCR扩增,结果同时得到了2条特异性的、大小与试验设计相符的419(NDV)和602 bp(DPV)的扩增条带,而对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出0.4 pg的NDV模板和126 pg的DPV模板。     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。     

鸭瘟病毒DNA的快速诊断研究

根据文献报道的鸭瘟病毒基因序列，设计合成了一对引物，其扩增跨幅为498bp。用这对引物，以采用纯水直接研磨临床病料组织再按常规酚一氟仿抽提DNA的方法制备模板，对2株鸭瘟病毒进行扩增，均获得了与设计大小相符的明亮条带，为阳性；而对其他7株非鸭瘟病毒病料的基因扩增不出任何条带，为阴性；以该PCR方法检测14份DPV临床病料，均为阳性，与病毒分离和血清中和试验的结果一致。敏感性试验表明可检测到10fg的鸭瘟病毒DNA模板。研究建立的直接从临床样品微量检测DPV的PCR方法，能达到鸭瘟病毒基因的快速诊断要求。     

鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

鸭圆环病毒病给养鸭业造成严重的经济损失,鉴于此,本研究根据GenBank登录的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)保守区基因组序列(登录号:NC_005053.1),设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性;第1轮扩增的灵敏度为10 pg,第2轮扩增的灵敏度为0.1 pg,通过巢式PCR,敏感性提高了100倍。本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于鸭圆环病毒的病原检测。     

鸭圆环病毒PCR检测方法的建立与应用

鸭圆环病毒病是由鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)引起的一种重要免疫抑制病,影响着我国养鸭业的发展。为建立针对DuCV的PCR快速检测方法,对GenBank中登录的DuCV全基因组序列进行遗传进化分析,通过对两种基因型的DuCV全基因组序列进行比对,在共同保守区筛选出1对引物,建立了可以同时检测DuCV两种基因型的PCR快速检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评价。结果显示,该方法具有良好的敏感性,检测下限达1.0 fg;特异性良好,对其他常见鸭病毒核酸检测均为阴性;利用该方法对20份临床发病鸭样品进行检测,发现有6份呈DuCV阳性,序列分析表明均属于DuCV-1。该PCR检测方法的建立为鸭圆环病毒病的快速诊断和防控提供了重要手段。     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

Establishment and Application of a Nested PCR Assay for Detection of Fowl Adenovirus Group Ⅰ

According to the sequence of hexon gene of fowl adenovirus groupⅠ(FAVⅠ) strain published in GenBank,two pairs of primers were designed and synthesized.The outer primers amplified a fragment of 475 bp in length, and the inner primers amplification fragment was 237 bp in length. A nested PCR assay for rapid detection of FAVⅠ was established.A specific 237 bp fragment was amplified from DNA templates of FAVⅠstrain,but no bands were amplified with templates extracted respectively from avian influenza virus (AIV) subtype H9,Newcastle disease virus (NDV), infectious bursal disease virus (IBDV),duck plague virus (DPV), reticuloendotheliosis (REV), avian reovirus (ARV), Marek's disease virus (MDV). Sensitivity of the 1st and 2nd amplifications by the nested PCR assay were 100 pg and 1 fg,respectively.The sensitivite of the 2nd amplifications increased by 10⁵ times.The results showed that the nested PCR was specific,sensitive,rapid,accurate,and could be used as a routine assay for the detection of FAVⅠ.This method had good reproducibility, specificity and sensitivity, and might detect low content FAVⅠ accurately and rapidly. This method could be used as a method for the diagnosis and detection of clinical cases,and molecular epidemiological investigation of FAVⅠ.     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。