乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

优化PCR条件扩增人IL-10 cDNA及其原核表达载体构建

目的：探讨PCR扩增人IL—10基因片段的最佳反应条件并构建人IL—10原核表达载体。方法：运用降落PCR扩增5端GC含量高的人IL—10基因片段，主要对退火温度和热启动等因素进行优化选择；载体和PCR产物经拓扑TA克隆技术连接，常规方法转化、筛选阳性重组质粒。结果：PCR反应的最佳退火温度为68.5℃，此时扩增出的DNA片段大小符合预期设想，并通过茵落PCR和DNA测序得到证实。结论：在上述条件下获得的PCR产物纯度高、非特异性产物少，成功地构建了人IL—10原核表达载体。并提示降落PCR是一种潜在的一步找到最佳扩增条件的方法。     

河北汉族人群醛固酮合成酶基因-344C/T多态性研究

目的对中国河北省正常人群CYP11B2基因-344C/T多态性分布特点进行初步研究。方法选取唐山市正常健康体检者,提取白细胞DNA,PCR扩增CYP11B片段,应用限制性内切酶HaeⅢ37℃酶切2h。酶切产物行25g/L琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下观察基因型。结果CYP11B2基因-344C/T多态性在河北正常人群中分布是CC16.0%、CT41.7%、TT52.5%,C等位基因为26.8%,男女之间基因型、等位基因频率差异无统计学意义(P=0.544、0.382)。CYP11B2基因-344C/T多态性分布与日本、芬兰、南非、法国、德国、比利时等国正常人群分布存在显著性差异,不同种族之间差异有统计学意义(P<0.004)。结论不同种族、不同地区正常人群CYP11B2基因-344C/T多态性分布存在明显差异。     

丹参酮ⅡA抑制醛固酮生物合成的作用

背景：醛固酮是左心室肥厚重要的致病因子，有证据提示中药丹参提取物能够干预醛固酮的生物合成。目的：探讨丹参酮ⅡA对心肌醛固酮合成相关基因表达的作用。设计：随机对照观察。单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院。材料：实验于2002—11／2004-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科实验室完成，选用12周龄雄性自发性高血压SHR大鼠20只，随机分为高血压组、丹参酮ⅡA组，每组10只。方法：丹参酮ⅡA组经尾静脉注射丹参酮ⅡA溶液1．5mg／（kg&;#183;d），高血压组给予相当容积的蒸馏水。给药12周后断头处死大鼠，留取心肌标本，通过反转录-聚合酶链反应，以GAPDH基因扩增引物表为内参照，分别测定心肌醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达。主要观察指标：心肌醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达水平。结果：20只大鼠被纳入实验，并全部进入结果分析，无脱失值。①两组大鼠心肌CYP11B1及CYP11B2基因表达的定性分析：以100bp Plus Ladder为Marker，分别在440bp,461bp及336bp处可见清晰的扩增条带，DNA测序证实为CYP11B1，YP11B2及GAPDH的编码基因片段。②两组大鼠心肌CYP11B1及CYP11B2基因表达的定量分析：丹参酮ⅡA组CYP11B1及CYP11B2的mRNA表达水平明显低于高血压组（0．924&;#177;0．121，1．343&;#177;0．132，P〈0．05；1．017&;#177;0．119，1．675&;#177;0．126，P〈0．01）。结论：丹参酮ⅡA可能通过直接下调心脏局部醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达，抑制心脏局部醛固酮的生物合成，从而发挥抗高血压左室肥厚的效应。     

一种优化的PCR方法——降落PCR扩增目的基因

目的：尝试用一种新的PCR方法－－降落PCR扩增目的基因。方法：在构建人CD137－hIgG1Fc－pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因。结果：扩增出的特异性条带与目的基因大小一致。结论：降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程，对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增，是一种行之有效的PCR方法。     

IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究

为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因（IgH）重排的最佳实验条件及SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性，以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增，对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究，找出最佳反应参数。并以通用引物进行了SYBR greenⅠ实时定量PCR对IgH重排基因的检测，测定了该法检测IgH重排基因的敏感性。结果表明：最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0．8μmol／L，0．5U的Taq酶量效果满意，最适dNTP浓度为100μmol／L，最适镁离子浓度为3．0mmol／L，最佳循环次数为40次。SYBR GreenⅠ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析，其对IgH重排基因检测的敏感性为10^4／ml。结论：确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的最适反应条件，实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增，初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测。     

丹参酮ⅡA抑制醛固酮生物合成的作用

背景醛固酮是左心室肥厚重要的致病因子,有证据提示中药丹参提取物能够干预醛固酮的生物合成. 目的探讨丹参酮ⅡA对心肌醛固酮合成相关基因表达的作用. 设计随机对照观察. 单位华中科技大学同济医学院附属同济医院. 材料实验于2002-11/2004-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科实验室完成,选用12周龄雄性自发性高血压SHR大鼠20只,随机分为高血压组、丹参酮ⅡA组,每组10只. 方法丹参酮ⅡA组经尾静脉注射丹参酮ⅡA溶液1.5 mg/(kg·d),高血压组给予相当容积的蒸馏水.给药12周后断头处死大鼠,留取心肌标本,通过反转录-聚合酶链反应,以GAPDH基因扩增引物表为内参照,分别测定心肌醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达. 主要观察指标心肌醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达水平. 结果20只大鼠被纳入实验,并全部进入结果分析,无脱失值.①两组大鼠心肌CYP11B1及CYP11B2基因表达的定性分析以100bp Plus Lad-der为Marker,分别在440 bp,461 bp及336 bp处可见清晰的扩增条带,DNA测序证实为CYP11B1,YP11B2及GAPDH的编码基因片段.②两组大鼠心肌CYP11B1及CYP11B2基因表达的定量分析丹参酮ⅡA组CYP11B1及CYP11B2的mRNA表达水平明显低于高血压组(0.924±0.121,1.343±0.132,P＜0.05;1.017±0.119,1.675±0.126,P＜0.01). 结论丹参酮ⅡA可能通过直接下调心脏局部醛固酮合成相关基因CYP11B1及CYP11B2 mRNA表达,抑制心脏局部醛固酮的生物合成,从而发挥抗高血压左室肥厚的效应.     

高分辨率熔解曲线法检测CBS基因SNP的技术优化

目的：探索高分辨率熔解曲线法（highresolutionmelting,HRM）检测胱硫醚β-合酶（CBS）基因SNP位点所需的最佳反应体系和条件,建立快速高效的对CBS基因分型的方法。方法通过普通PCR初步确立引物的退火温度范围,在实时荧光定量PCR（qPCR）-HRM反应中调整确定最佳退火温度。对影响qPCR-HRM的因素包括反应程序、模板DNA、MgCl2再分别进行优化,确立最佳反应体系和反应条件,对在此基础上得出的基因分型结果通过测序验证其准确性,从而建立系统的HRM检测CBS基因SNP的方法。结果HRM检测CBS基因该片段最佳退火温度为62℃,qPCR-HRM最佳反应体系为20μl,引物浓度为0．2μmol/L,Mg2＋为2．5μmol/L,模板DNA为60ng。在优化的体系条件下筛选出的突变型样本经测序验证与实验结果一致。结论HRM可以作为检测SNP准确、经济、高效的方法。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

原发性高血压患者醛固酮合酶基因多态性与血浆醛固酮水平的关系研究

目的 :探索武汉地区汉族高血压人群醛固酮合酶CYP11B2基因 3 44C/T多态性与血浆醛固酮 (pAldo)水平的相关性。方法 :应用PCR RELP技术对 10 6例武汉地区汉族高血压病人的CYP11B2基因 3 44C/T多态性进行分析 ,应用放射免疫法测定 10 6例武汉地区汉族高血压病人的血浆醛固酮水平。结果 :武汉地区汉族高血压人群CYP11B2基因 3 44C/T多态性以TT和CT为主要基因型 ,C等位基因较少见 ,其频率为 0 2 5。高血压患者血浆醛固酮水平在CYP11B2基因 3 44C/T的 3个不同基因型组中差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 :武汉地区高血压人群的血浆醛固酮水平与CYP11B2基因 3 44C/T多态性相关 ,且高醛固酮水平与C等位基因相关。     

IPaH-1基因在志贺氏菌表达的检测及PCR条件的优化

目的检测IPaH1基因在志贺氏菌特异性表达水平并对PCR条件进行优化。方法应用设计的针对IPaH1基因的特异性引物,通过PCR法检测IPaH1基因在鲍氏志贺氏菌、野生志贺氏菌、大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌的表达水平,并对PCR反应中退火温度、最佳引物浓度等进行优化。结果①在志贺氏菌检测到IPaH1基因特异性表达,而大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌未见表达;②PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因时,第一对引物IPaH1-1的最适退火温度为55.0℃-59.0℃,第二对引物IPaH1-2为51.0℃-55.0℃;两对引物理想终浓度均为0.1μM。结论 IPaH1基因特异表达于志贺氏菌;应用设计的引物通过PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因的最适退火温度分别为55.0℃-59.0℃、51.0℃-55.0℃,最适引物终浓度均为0.1μM。     

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率

背景：血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。目的：探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。方法：提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。结果与结论：97℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2％二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。     

Droplet digital PCR improves urinary exosomal miRNA detection compared to real-time PCR

ObjectQuantification of urinary miRNAs can be challenging especially for low abundance miRNAs. We aimed to optimize the quantification of urinary exosomal miRNAs and compare the performance efficiency between droplet digital PCR (ddPCR) and real-time quantitative PCR (qPCR).MethodsWe optimized a number of parameters for ddPCR such as annealing temperatures, annealing time and PCR cycle number. We also compared the performance of ddPCR and qPCR.ResultsBy comparing the fluorescence amplification separation, the optimal annealing temperature was 59 °C, optimal annealing time was 60s and optimal cycle number was 45 for measuring urinary exosomal miRNAs. ddPCR had much higher technical sensitivity compared to qPCR. The minimal detectable concentration of miR-29a was <50 copies/μL by ddPCR compared to 6473 copies/μL for qPCR. Also, ddPCR generated more consistent results for serially diluted samples compared to qPCR. ddPCR generated smaller within-run variations than qPCR though this did not reach statistical significance. It also resulted in better reproducibility with smaller between-run variations.ConclusionsOptimization of urinary exosomal miRNA ddPCR assay is dependent on assessing key variables including experimental annealing temperature and time as well as the number of PCR cycles. ddPCR has a higher sensitivity, reproducibility, and accuracy in comparison to qPCR.     

儿童Gitelman综合征一例并文献复习

目的 :分析1例Gitelman综合征患儿的临床表现及基因检测结果 ,以提高医师对Gitelman综合征的认识。方法:分析1例Gitelman综合征患儿的临床资料,行SLC12A3基因检测,并结合文献资料进行分析、诊断。结果:患儿表现为低钾性代谢性碱中毒、低镁血症、低钙尿症、高镁尿症,而其血清肾素和血管紧张素水平增高,但血压正常;检测到SLC12A3基因5个变异,但未检测到致病性突变。结论:应提高对Gitelman综合征的认识,以防漏、误诊。     

两种分析miRNA相对表达量方法的比较研究

目的基于实时反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）基因表达相对定量的分析方法：GenEx软件分析与2（-△△CT）法,建立一种简便、准确的miRNA相对定量方法。方法以HK-2细胞系cDNA为模板,进行PCR扩增,确定最佳退火温度;再倍比稀释该模板,用荧光定量PCR测定的ct值作miR-122和miR-16的标准曲线,计算出相应miRNA的扩增效率。用荧光定量PCR测定健康者和乙型肝炎患者血清中内参miR-16和靶基因miR-122的表达,分别采用GenEx软件分析与2（-△△CT）法来评价相对表达量。结果系列稀释法制作的标准曲线呈现较好的线性相关性,两种miRNA的标准曲线r2值均为0．999,miR-16的扩增效率为97％,miR-122扩增效率为107％。2（-△△CT）法分析乙型肝炎患者血清中miR-122的表达较健康者增高了44．3倍,而GenEx软件分析为54．1倍。结论GenEx软件分析考虑了更多的影响因素,其结果比（-△△CT法更可靠,适用于临床分析。     

焦磷酸测序法在幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因检测及药物疗效评价中的应用

目的本研究建立了幽门螺杆菌(Hp)克拉霉素耐药基因检测的焦磷酸测序方法,在获知耐药情况的同时根据半定量结果初步评估治疗效果。方法通过考察最合适的扩增引物、体系、退火温度建立最优的PCR扩增体系。分别对方法的灵敏度,特异性及一致性进行了评价。通过对44例临床标本的检测,比较本方法与快速尿素酶试验和13 C呼气试验的检出率。结果最优的PCR扩增体系为HiFi体系,最佳退火温度为59.8℃。本方法特异性良好,灵敏度达到100 copies/μL,与Sanger测序结果100.0%一致。36例标本快速尿素酶和焦测序法的检出率分别为48.7%和81.1%,耐药率为10.81%。8例标本13 C呼气试验和焦测序法的检出率分别为75.0%和87.5%,阳性标本检出一致率为100.0%。结论焦测序检测方法具备灵敏度高、快速、半定量的特点,为临床Hp克拉霉素耐药检测及初步疗效评价提供了一种新的方法。     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

Competitive amplification and unspecific amplification in polymerase chain reaction with confronting two-pair primers

Polymerase chain reaction with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) is an inexpensive, time-saving genotyping method that is applicable for most single nucleotide polymorphisms. To date, we have applied PCR-CTPP successfully for the genotyping of more than 30 polymorphisms. This paper demonstrates the differences in DNA amplification among different annealing temperatures of PCR-CTPP with given melting temperatures for four primers. The NQO1 C609T (Pro187Ser) polymorphism was used as an example. Two sets of four primers were applied for PCR-CTPP; the first set with different melting temperatures (Tms), and the second with similar Tms. The comparisons with one-pair primer PCR (allele-specific PCR) revealed that PCR-CTPP amplified DNA more specifically than allele-specific PCR. The primers with different Tms caused competitive DNA amplification for heterozygous genotype. Four primers with similar Tms amplified both alleles unspecifically at a lower annealing temperature, while the same DNA samples were correctly genotyped under an optimal annealing temperature. These findings are unique for PCR-CTPP, and important characteristics when the primers and annealing temperatures in PCR-CTPP are designed. The knowledge of these characteristics will extend the applicability of PCR-CTPP for polymorphism genotyping.