AMPK在维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞自噬中的作用研究

目的：研究维生素E琥珀酸酯（VES）是否影响人胃癌SGC-7901细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性,并探讨AMPK在VES诱导自噬中的作用。方法：用不同剂量（5、10、15、20 μg/mL）VES处理SGC-7901细胞24 h,以及20 μg/mL VES分别处理SGC-7901细胞3、6、12、24 h后,Western blot法检测SGC-7901细胞中自噬标志蛋白LC3、Beclin-1及AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表达。用RNAi技术沉默AMPK,20 μg/mLVES处理SGC-7901细胞24 h,Western blot法检测LC3、Beclin-1蛋白以及AMPK、mTOR、p70S6K与4EBP-1及其磷酸化蛋白表达,并采用荧光定量PCR法检测LC3 mRNA表达情况。结果：VES处理SGC-7901细胞后,与对照组比较,随着VES剂量的增加、作用时间的增长,AMPK磷酸化水平上升,LC3、Beclin-1蛋白表达增加（P<0.05）。RNAi沉默AMPK后,与单纯VES处理组比较,LC3、Beclin-1蛋白表达降低,LC3 mRNA表达下降（P<0.05）;mTOR、p70S6K及4EBP-1磷酸化活性升高（P<0.05）。结论：VES可诱导SGC-7901细胞中AMPK活化,AMPK活化后影响mTOR及其下游分子活性,继而诱导自噬的发生。     

维生素E琥珀酸酯处理人胃癌细胞过程中自噬与内质网应激的交互作用

目的:探讨维生素E琥珀酸酯(VES)处理人胃癌SGC-7901细胞过程中自噬与内质网应激的交互作用。方法:用不同剂量(0、5、10、15、20 μg/mL)VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h后,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3(LC3)荧光强度和分布情况,Western blot分别检测内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(GRP94)和LC3、Beclin-1的表达情况;在分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)以及内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理2 h后,以20 μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h,Western blot分别检测内质网应激标志物GRP78、GRP94及自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的变化。结果:与阴性对照组比较,随着VES剂量的增加,激光共聚焦显微镜观察到LC3在细胞内点状分布逐渐聚集和增强,GRP78和GRP94表达先降低后升高(P均<0.05),LC3和Beclin-1表达逐渐升高(P均<0.05);VES+3-MA组及VES+CQ组的GRP78和GRP94蛋白表达均高于单独VES组(P均<0.05);VES+4-PBA组的LC3和Beclin-1蛋白表达均低于单独VES组(P均<0.05)。结论:VES处理人胃癌细胞过程中自噬与内质网应激可以相互调节,具有交互作用。     

维生素E琥珀酸酯通过Akt/mTOR信号通路诱导人胃癌细胞SGC-7901发生保护性自噬

目的： 观察维生素E琥珀酸酯 (vitamin E succinate,VES)处理SGC-7901细胞后是否发生自噬,并探讨自噬在VES抑制细胞增殖中的作用。方法：用不同浓度 (0、5、10、15、20 μg/mL)VES处理SGC-7901细胞24 h后,电子显微镜观察自噬体形态;VES处理转染GFP-LC3质粒后的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察自噬情况;Western blot检测自噬标志蛋白LC3,以及Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR活性变化;采用自噬抑制剂氯喹 (chloroquine,CQ)和3-甲基腺苷 (3-methyladenine,3-MA)处理细胞后,MTT法检测细胞的增殖能力。结果：电子显微镜观察显示经不同浓度VES处理后,细胞中出现了典型的自噬囊泡以及自噬溶酶体等自噬各阶段的形态变化;荧光显微镜观察显示GFP-LC3质粒转染后随VES处理剂量的增加,绿色点状荧光逐渐聚集增强;Western blot结果显示,VES可使LC3-Ⅱ蛋白表达增强;并下调Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR的活性;MTT结果显示VES+CQ组和VES+3-MA组的细胞增殖抑制率均明显高于VES单独处理组 (P均 <0.05),即自噬抑制剂CQ与3-MA预处理使细胞增殖率进一步下降,提示VES诱导的肿瘤细胞自噬对肿瘤细胞增殖具有保护作用。结论：VES可以通过抑制Akt/mTOR通路活性诱导人胃癌细胞SGC-7901细胞发生自噬,且此种自噬为保护性自噬。     

维生素E琥珀酸酯处理人胃癌细胞过程中自噬与活性氧蓄积的交互作用

目的：探讨维生素E琥珀酸酯（VES）处理人胃癌SGC-7901细胞过程中自噬与活性氧（ROS）蓄积是否存在交互作用。方法：不同剂量（0、5、10、15、20 μg/mL）VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h,采用免疫荧光染色观察细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3（LC3）的荧光强度和分布情况,Western blot检测自噬标志蛋白LC3和Beclin-1的表达情况,流式细胞术检测细胞内ROS水平;用ROS淬灭剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理2 h后以20 μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h,免疫荧光染色观察细胞内LC3荧光强度和分布情况,Western blot检测LC3和Beclin-1的表达情况;RNA瞬时干扰阻断BECN-1基因的表达后,以20 μg/mL VES处理人胃癌SGC-7901细胞24 h,流式细胞术检测细胞内ROS水平。结果：与对照组相比,随着VES作用剂量的增加,LC3的荧光强度逐渐增强;LC3和Beclin-1蛋白表达均逐渐升高;流式细胞术检测结果显示胞内ROS水平逐渐增强;淬灭ROS之后LC3荧光强度以及LC3和Beclin-1蛋白表达水平均明显低于VES单独处理组（P<0.05）;阻断自噬关键基因BECN-1后细胞内ROS水平高于VES单独处理组（P<0.05）。结论：VES可诱导人胃癌细胞发生自噬及ROS蓄积,并且VES处理人胃癌细胞过程中自噬与ROS水平可以相互调节,具有交互作用。     

熊果酸对胃癌细胞株MGC-803 凋亡和自噬的调控及其作用机制

[摘要] 目的:观察熊果酸(UA)对胃癌细胞株MGC-803 自噬和凋亡的调控作用,并探讨UA基于PI3K/AKT/mTOR信号通路诱发MGC-803 细胞自噬的机制。方法:体外培养人胃癌细胞株MGC-803,分为空白对照组、UA干预组和UA+3-MA组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染细胞法检测各组细胞自噬发生情况,qPCR实验检测各组细胞LC3B、BAX、Bcl-2 mRNA的表达水平,WB实验检测各组细胞Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1、LC3B、BAX、Bcl-2 蛋白的表达水平。结果: 与空白对照组相比,UA干预组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染法显示,与空白对照组相比,UA 干预组绿色和红色荧光亮点数均显著增加（P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组绿色和红色荧光亮点数均显著减少（P<0.05）。qPCR和WB实验结果显示,与空白对照组相比,UA干预组BAX和LC3B mRNA和蛋白以及ULK1 蛋白表达水平均显著上调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平以及Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著下调（均P<0.05）;与UA干预组相比,UA+3-MA组BAX、LC3B mRNA和蛋白表达水平显著下调,Bcl-2 基因和蛋白表达水平显著上调（均P<0.05）,Ⅰ型PI3K、p-AKT、p-mTOR 和ULK1 蛋白表达水平无显著差异（P>0.05）。结论: UA诱导的自噬可以促进胃癌细胞MGC-803 的凋亡,其机制可能与UA参与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达有关。     

氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制

  目的  研究自噬对顺铂（cisplatin,DDP）诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡的影响,并初步探讨其可能机制。  方法  DDP和（或）氯喹处理胃癌SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,MDC染色后荧光显微镜观察自噬囊泡,West. ern Blot检测自噬和凋亡相关蛋白。  结果  5 mg/L的顺铂作用于胃癌SGC7901细胞24 h,细胞凋亡率为21.07%±2.12%,同时观测到自噬囊泡增多和LC3-Ⅱ蛋白表达升高;氯喹特异性抑制自噬活性后,提高了顺铂诱导的细胞凋亡率（30.16%±3.54%,P < 0.05）;检测到凋亡相关蛋白Caspase-3和P53表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。  结论  自噬在顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的过程中起保护作用,氯喹抑制自噬后,可能通过激活P53蛋白及灭活Bcl-2蛋白的表达来促进细胞凋亡,联合应用顺铂和氯喹有望成为胃癌治疗的新策略。      

抑制自噬通过促进Caspase依赖性细胞凋亡逆转鼻咽癌紫杉醇耐药性的研究

摘 要：［目的］ 探讨细胞自噬在鼻咽癌紫杉醇耐药中的作用及其机制。［方法］ 以鼻咽癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞为研究对象。自噬抑制剂3-MA抑制自噬,siRNA下调自噬蛋白Beclin-1的表达,分别应用集落形成实验检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测凋亡水平,蛋白印迹分析检测自噬相关蛋白和Caspase蛋白的表达水平,透射电子显微镜和荧光显微镜进行细胞形态学观察。通过基因芯片技术分析Caspase家族基因在亲本和耐药细胞中的不同表达。［结果］ 紫杉醇耐药细胞中自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平高于亲本细胞（P<0.05）。用自噬抑制剂3-MA预处理鼻咽癌耐药细胞后,CNE-1/Taxol+3-MA和HNE-2/Taxol+3-MA细胞的IC50值分别为(6.25±1.0)nmol/L、(2.19±0.19)nmol/L,与对照组相比,细胞的生长抑制率明显增加（P<0.01）。鼻咽癌紫杉醇耐药细胞转染Beclin-1-siRNA后,CNE-1/Taxol细胞和HNE-2/Taxol细胞的IC50值分别为(5.69±1.23)nmol/L、(3.08±0.67)nmol/L,转染后的细胞对紫杉醇的敏感性明显高于阴性对照组。通过3-MA和Beclin-1-siRNA抑制自噬能增加紫杉醇诱导的Caspase依赖的细胞凋亡,同时能部分逆转鼻咽癌细胞紫杉醇耐药。［结论］ 紫杉醇诱导的鼻咽癌细胞自噬可能是通过降低Caspase依赖的细胞凋亡,从而部分参与了紫杉醇耐药,抑制自噬能通过促进凋亡从而增加鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

TGF-β1通过诱导自噬促进胃癌SGC7901细胞侵袭

目的:探讨转化生长因子(TGF-β1)诱导人胃癌SGC7901细胞发生自噬的作用及其对细胞侵袭能力的影响.方法:将体外培养的人胃癌SGC7901细胞用不同浓度TGF-β1处理24 h,采用Western blot 法检测细胞中自噬标记蛋白LC3和Beclin1的表达水平.Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化.结果:TGF-β1可显著诱导人胃癌SGC7901细胞发生自噬,且随着浓度增加自噬表达水平逐渐升高.自噬抑制剂3-MA能够阻断TGF-β1诱导的自噬.此外,TGF-β1可显著增强人胃癌SGC7901细胞的迁移和侵袭能力,而自噬抑制剂3-MA能够逆转这一过程.结论:TGF-β1通过诱导自噬发生从而促进人胃癌SGC7901细胞的侵袭.     

自噬在吉西他滨诱导肺癌细胞A549凋亡中的作用及其相关机制

  目的  研究自噬对吉西他滨(gemcitabine, GEM)诱导的肺癌细胞A549凋亡的影响并探讨其可能机制。  方法  MDC染色后采用荧光显微镜对自噬进行形态观察; 以CCK8检测3-MA抑制自噬前后经吉西他滨诱导的A549细胞存活率; RT-PCR检测自噬相关基因Beclin-1表达的变化。Western blot分别检测自噬相关性蛋白Beclin-l及凋亡活化蛋白Caspase-3的变化。  结果  吉西他滨可诱导肺癌细胞A549产生自噬, 自噬在基因及蛋白水平表达均增加; 3-MA和吉西他滨联合用药可增强肺癌A549细胞凋亡。  结论  吉西他滨诱导肺癌细胞A549凋亡的过程中自噬可能起到保护作用, 3-MA特异性抑制自噬后可增强吉西他滨诱导的A549细胞凋亡。      

全反式维甲酸对人胃腺癌细胞中Akt及其磷酸化蛋白表达的影响

目的研究全反式维甲酸（alltrans-retinoic acid,ATRA）对人胃腺癌细胞（SGC-7901）中Akt及其磷酸化蛋白p—Akt（Ser473）和p—Akt（Thr308）表达的影响及其对细胞凋亡的诱导作用。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法检测ATRA对SGC-7901增殖的抑制作用;荧光混微镜观察细胞凋亡形态;Western blot方法检测不同浓度ATRA处理后的SGC-7901细胞中Akt、p-Akt（Ser473）和p-Akt（Thr308）的表达情况。结果ATRA对SGC-7901细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性;ATRA处理48h时,荧光显微镜观察细胞呈现明显的凋亡形态学改变;Western blot检测显示ATRA对细胞中Akt蛋白的表达没有明显影响,但显著下调两种p-Akt蛋白的表达。结论ATRA诱导SGC～7901细胞凋亡可能与其抑制磷酸化Akt蛋白表达有关。     

内质网应激在芹菜素诱导胃癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨内质网应激在芹菜素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用。方法:采用Western blot方法检测不同剂最(0、20、40、60、80μmol/L)芹菜素作用48 h和60μmol/L芹菜素作用不同时间(0、12、24、48 h)后对胃癌SGC-7901细胞中内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白(glucose regulative protein,GRP)GRP78、GRP94和内质网应激凋亡途径关键因子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologousprotein,CHOP)表达的影响;并用DAPI荧光染色和流式细胞仪检测10 mmol/L内质网应激抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyrie acid,PBA)加入前后细胞凋亡情况的变化。结果:芹菜素可以诱导GRP78、GRP94蛋白的表达,并随着剂量和时间的增加蛋白表达量也呈增加趋势,但芹菜素不能诱导CHOP蛋白的表达;荧光染色和流式细胞术结果显示4-PBA与20μmol/L芹菜素联合作用组的细胞凋亡率明显增加,与20μmol/L芹菜素组及溶剂对照组间的差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)。结论:内质网应激在芹菜素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡中可能对细胞起到保护作用。     

EPHA2通过增强Akt/mTOR信号通路促进SGC-7901细胞的增殖

背景与目的：EPHA2能够促进胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程,从而增强胃癌细胞的增殖能力,但EPHA2调控胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程的分子机制依然不明确。Akt/mTOR信号通路能够通过促进胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程增强胃癌细胞的增殖能力,且有研究表明EPHA2能够激活Akt/mTOR信号通路。基于此,该研究探讨了Akt/mTOR信号通路在EPHA2促胃癌细胞增殖中的作用。方法：采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测过表达EPHA2和敲低EPHA2表达对SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1磷酸化的影响。使用Akt抑制剂MK2206和mTOR抑制剂RAD001分别处理转染空载体病毒的SGC-7901-NC细胞和过表达EPHA2的SGC-7901-EPHA2细胞,分别通过CCK8、流式细胞术和Western blot检测细胞增殖、细胞周期及周期相关蛋白Cyclin D1的表达。结果：过表达EPHA2增强SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化,敲低EPHA2的表达抑制SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化。MK2206和RAD001处理细胞时,EPHA2过表达对SGC-7901细胞增殖、细胞S期和Cyclin D1表达的促进作用被显著抑制。结论：EPHA2通过增强Akt/mTOR信号通路促进胃癌细胞SGC-7901的增殖能力,提示我们将来针对EPHA2高表达的胃癌患者或许可以采用Akt抑制剂和mTOR抑制剂予以个体化治疗。     

姜黄素下调mTOR诱导人肺癌A549细胞自噬的研究

[目的]研究姜黄素诱导人肺癌A549细胞自噬现象及与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的关系。[方法]采用CCK-8法检测姜黄素对A549细胞增殖的抑制作用;采用吖啶橙染色（AO）及转染GFP-LC3质粒荧光显微镜下观察姜黄素处理后A549细胞的自噬现象;采用Western blot法检测微管相关蛋白轻链Ⅱ（LC3Ⅱ）、微管相关蛋白轻链Ⅰ（LC3Ⅰ）、mTOR表达的变化。[结果]姜黄素对人肺癌A549细胞增殖有明显抑制作用,且成明显的剂量—时间依赖关系。AO染色结果显示,与对照组相比,姜黄素40μmol/L组及Rapa组细胞内酸性滤泡染成亮红色荧光比例增多;与姜黄素40μmol/L组相比,姜黄素40μmol/L＋自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组及3-MA组亮红色荧光比例下降。细胞转染GFP-LC3后姜黄素40μmol/L组和Rapa组胞浆内点状的绿色荧光斑点明显;与姜黄素40μmol/L组相比,姜黄素40μmol/L＋3-MA组及3-MA组胞浆内点状的绿色荧光斑点明显比例有所下降。Western blot法检测结果显示,与对照组相比,姜黄素40μmol/L组作用24h后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著升高（P〈0.05）,姜黄素40μmol/L＋3-MA组LC3Ⅱ/LC3-Ⅰ表达低于姜黄素40μmol/L组（P〈0.05）。姜黄素40μmol/L组mTOR表达显著下降（P〈0.01）,姜黄素40μmol/L＋3-MA组mTOR表达高于姜黄素40μmol/L组（P〈0.05）。[结论]姜黄素能够明显抑制A549细胞增殖并诱导A549细胞发生自噬,同时还能够明显抑制mTOR蛋白的表达水平,其机理可能与mTOR的信号通路有关。     

石蒜碱通过TGF-β/Smad 信号通路调控自噬抑制食管癌细胞增殖

目的:探讨石蒜碱对食管癌细胞增殖的影响,并分析其机制。方法:细胞计数8（CCK-8）法分析细胞增殖抑制率,MDC染色法检测自噬泡,Western blot法分析LC3II/LC3I、Beclin-1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、p-Smad2/Smad2水平,观察3-MA对石蒜碱调控自噬和凋亡的影响。裸鼠成瘤实验验证石蒜碱对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬、p-Smad2/Smad2水平的影响。结果:2、4、8、16、32、64 μmol/L的石蒜碱抑制ECA109细胞增殖（F=22.412,P＜0.05）,IC50值为（15.56±2.16）μmol/L。4、8、16 μmol/L石蒜碱促进自噬泡的产生,增加LC3II/LC3I、Beclin-1水平,降低TGF-β1、p-Smad2/Smad2水平（P＜0.05）;3-MA可以逆转石蒜碱对自噬、凋亡及TGF-β/Smad信号通路和Bcl-2/Bax信号通路的影响;体内实验显示,100 mg/kg石蒜碱能降低瘤体体积、瘤体质量,下调p-Smad2/Smad2水平,上调LC3II/LC3I水平（P＜0.05）。3-MA可以逆转石蒜碱对瘤体体积、瘤体质量及LC3II/LC3I、p-Smad2/Smad2水平的影响。结论:石蒜碱能抑制ECA109细胞的增殖,促进细胞凋亡,对体内ECA109细胞移植瘤抑瘤效果明显,其机制与调控TGF-β/Smad信号通路激活自噬有关。