c-myc特异性小分子干扰RNA对体外培养HL-60细胞增殖、细胞周期及C-myc蛋白表达的作用

目的:研究针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对HL-60细胞增殖及内源性c-myc基因表达的影响,探讨应用siRNA进行白血病基凶治疗的可能性.方法:取倍增期HL-60细胞分空白对照组、阴性对照组、转染组3组,培养24～96 h后收获细胞进行检测.采用MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞仪进行细胞周期分析,逆转录PCR方法检测c-myc mRNA表达的变化,免疫细胞化学染色法检测C-myc蛋白表达的改变.结果:分组培养后,转染组细胞增殖较2个对照组受到抑制(P均<0.05),其抑制作用于转染后48、72 h最明显(P均<0.05).转染组S期细胞比值由空白对照组的(56.1±4.7)%降至(29.2±3.5)%,G./G1 期细胞由(36.8±3.3)%升高至(53.6±4.3)%,差异有统计学意义(P均<0.05).c-myc siRNA对目的基因mRNA表达的抑制作用于24 h最明显(P<0.05),96 h抑制作用基本消失(P>0.05).转染组细胞中C-myc蛋白表达与2个对照组相比降低(P均<0.05).结论:针对c-myc基因的siRNA对HL-60细胞增殖及内源性c-myc基因表达有抑制作用,有望为白血病提供新的治疗靶位点.     

siRNA干扰AEG-1对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨星形胶质细胞上调基因1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)表达水平对人胰腺癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究其可能的分子机制。 方法 采用RNAi技术抑制AsPC-1细胞中AEG-1表达,采用Western blot检测转染前后AEG-1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和AEG-1 siRNA转染组3组。采用MTT法和流式细胞术分析AEG-1基因沉默后对人胰腺癌AsPC-1细胞生长及周期的影响。 结果 Western blot检测结果显示,AEG-1 siRNA转染48 h后,AsPC-1细胞中AEG-1蛋白相对灰度值为0.10±0.09,明显弱于未转染对照组的0.69±0.24和脂质体转染组的0.70±0.21(P<0.05),而未转染对照组和脂质体转染组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。转染AEG-1 siRNA的AsPC-1细胞其AEG-1基因表达量下降了82%。MTT法检测结果显示,AEG-1 siRNA干扰AsPC-1细胞后,AEG-1 siRNA干扰组AsPC-1细胞生长减慢(P<0.05)。FCM法检测结果显示,AEG-1基因沉默后,与未转染对照组和脂质体转染组相比,G₀/G₁期细胞的比例明显升高(P<0.05),S期的比例显著下降(均P<0.05)。 结论 RNA干扰AEG-1基因表达后可明显抑制人胰腺癌AsPC-1细胞增殖,且其抑制增殖作用与改变细胞周期的分布有关。      

人乳头瘤病毒16E6基因沉默对鼻咽癌细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响

目的 观察针对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 E6基因的RNA干扰(RNA inteffering,RNAi)对人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)HNE-1细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响,探讨HPV16 E6基因作为鼻咽癌基因治疗标靶的可行性.方法 根据基因库上的HPV16 E6 mRNA序列,设计合成针对HPV16 E6的siRNA,转染HNE-1细胞,采用RT-PCR及Western blot分析E6基因的表达,利用侵袭实验检测细胞的侵袭能力,MTT法检测细胞的生长增殖,流式细胞术检测细胞周期.结果 针对HPV16 E6的siRNA下调鼻咽癌HNE-1细胞株E6 mRNA和蛋白表达水平,分别下调66.3%、56.7%(P<0.05);侵袭实验结果 显示,siRNA转染组的穿膜细胞数为(45.3±4.0),显著低于阴性对照组[(147.7±4.7),P<0.05];转染组细胞的增殖受到抑制,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术显示细胞阻滞于G0/G1期.结论 siRNA可以有效干扰鼻咽癌HNE-1细胞内HPV16 E6基因的表达,进而影响HNE-1细胞的侵袭转移能力,并抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布.     

下调VEGF—C基因对乳癌细胞增殖和凋亡影响

目的 应用经过化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体外抑制血管内皮生长因子C(VEF-C)基因的表达, 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术对乳癌基因治疗的可行性和特异性.方法 设计针对VEF-C基因的siRNA,选用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂,以脂质体转染法将双链siRNA导入人乳癌细胞株MCF-7细胞,设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组(每孔只加LipofectamineTM 2000 0.5 μL)、3个siRNA浓度梯度组(50、100、200 nmol/L)及siRNA SCR组(100 nmol/L),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测siRNA对 MCF-7细胞增殖的影响,通过Hoechst 33258 染色观察MCF-7细胞的凋亡,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测转染前后VEF-C基因和p53基因的 mRNA及蛋白表达变化.结果 转染VEF-C siRNA 8 h后MCF-7细胞生长受到抑制,Hoechst 33258荧光染色显示转染siRNA 72 h后细胞内可见凋亡小体.VEF-C基因和p53基因 mRNA和蛋白水平表达明显降低(F=30.7～11.11,q=5.7～20.75,P<0.01),空白对照组、脂质体组和siRNA SCR组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 化学修饰的siRNA介导的RNA干扰能下调靶基因VEF-C的表达和抑制MCF-7细胞增殖,乳癌中p53与VEF-C表达有关,提示突变型p53可能参与VEF-C表达的调控.     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

靶向EGFR基因RNA干扰对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNA干扰技术下调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的表达,观察其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建针对EGFR基因的siRNA真核表达载体,转染入卵巢癌SKOV_3细胞中,并筛选稳定表达siRNA的转化克隆,RT-PCR及Western blot分别检测EGFR mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,克隆形成实验及MTY法检测细胞克隆形成率及细胞体外的增殖情况.结果 成功构建表达质粒pGenSil-HK、pGcnSil-EGFRI和pGenSil-EGFR2,并转染SKOV,细胞,通过G418筛选后获得稳定转染克隆,RT-PCR及Western blot分析表明转染pGenSil-EGFRI、pGenSil-EGFR2后的细胞EGFR mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制,FGFR mRNA抑制率分别为41.87%和68.07%,蛋白表达抑制率分别为45.21%和70.25%.与未转染组和pGenSil-HK组相比,pGenSil-EGFR2组细胞凋亡比例显著增加,G_1期细胞增多,而S期细胞减少(P<0.05);转染pGenSil-HK组克隆形成率为(0.82±0.03),转染pGenSil-EGFR2组克隆形成率为(0.61±0.04),二者比较差异显著(P<0.05),MTT显示细胞培养36 h后,pGenSil.EGFR2组的细胞生长均显著低于未转染组和转染pGenSil-HK组(P<0.05).结论 靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑卵巢癌SKOV_3细胞中的EGFR表达,诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布、抑制细胞增殖.     

RNA干扰抑制c-myc基因表达对D341细胞增殖的影响

目的探讨应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制髓母细胞瘤D341细胞株的c-myc基因对D341细胞的生长、细胞周期及凋亡的变化。方法制备特异性针对c-myc基因的siRNA,转染D341细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测c-myc基因表达情况,流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测。结果siRNA转染D341细胞后,c-myc基因表达在转染后24h抑制效率最高,c-myc蛋白在48h抑制效率最高,并随siRNA浓度的增大,沉默c-myc基因效率增高。RNA干扰抑制D341细胞c-myc基因后,细胞生长停滞于G1期。结论针对c-myc基因的siRNA对D341细胞c-mycmRNA及蛋白有明显抑制作用,细胞生长受到抑制,有望成为髓母细胞瘤的新的治疗途径。     

Eg5基因在神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用

目的探讨Eg5基因对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖和凋亡的影响。方法取2株NB细胞株SHSY-5Y和NBL-S,分别转染针对Eg5基因的小干扰RNA(siRNA),分为细胞对照组(用等体积的水代替siRNA,只含有脂质体,未转染细胞)、siRNA对照组(转染siRNA对照)和siRNA干扰组(转染Eg5 siRNA),每组6孔,每孔1×10~6个细胞。使用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Eg5 mRNA表达水平的变化;使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和克隆形成实验检测下调Eg5表达对NB细胞增殖的影响;使用流式细胞术检测下调Eg5表达对NB细胞凋亡和细胞周期的影响。结果荧光定量PCR检测结果显示,siRNA干扰组Eg5 mRNA表达水平与细胞对照组和siRNA对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);EdU掺入实验和克隆形成结果表明,siRNA干扰组细胞中DNA的合成量和细胞克隆数量低于细胞对照和siRNA对照组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞的凋亡比率低于siRNA干扰组细胞的凋亡比率,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期的检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞中G0/G1期所占比率<50%,而siRNA干扰组细胞中G0/G1期所占比率>70%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在NB细胞中使用siRNA下调Eg5表达,能够抑制NB细胞增殖,促进细胞凋亡。     

鼻咽癌CNE-2细胞株胰岛素样生长因子-1受体和表皮生长因子受体沉默的放疗增敏机理

目的:评价RNA干扰(RNAi)同时沉默胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和表皮生长因子受体(EG-FR)后生物学特性变化及对鼻咽癌CNE2细胞株放疗敏感性的改变。方法:构建荧光标记的靶向IGF-1R及EGFR信使RNA真核表达质粒,质粒转染鼻咽癌CNE2细胞株,共聚焦显微镜观察细胞转染结果,行平板克隆实验检测细胞存活分数;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western-blot法检测细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc。结果:成功构建真核表达质粒;siRNA-IGF-1R和EGFR组的细胞存活分数显著降低(P<0.05),与对照组相比,凋亡率显著增高(P<0.05),G0/G1期细胞比例明显增多,而S期和G2/M期细胞比例明显减少,细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc蛋白表达降低(P<0.05)。结论:RNA同时干扰沉默IGF-1R和EGFR可以引起鼻咽癌细胞周期蛋白表达降低,细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。     

RNAi抑制鼻咽癌细胞表皮生长因子受体表达对细胞生长的影响

目的利用RNAi技术抑制鼻咽癌细胞5-8F表皮生长因子受体（EGFR）表达,观察细胞生长变化,探讨EGFR与鼻咽癌发生发展之间的相关性。方法利用体外转录法合成EGFR特异性siRNA,将其瞬时转染5-8F．收集转染后细胞总RNA和蛋白,利用RT．PCR和Western blot法测定EGFR表达水平的变化,并检测EGFR表达抑制后细胞生长速度和生长周期的变化。结果合成的3对siRNA中,有一对使EGFR mRNA表达下降67．5％,蛋白表达下降77％。EGFR表达抑制后5．8F生长速度减慢,并诱导细胞周期停止在G1期。结论RNAi沉默EGFR表达可抑制鼻咽癌细胞生长,并诱导癌细胞停止在G1期,RNAi可作为探索鼻咽癌发生发展机制和基因治疗的有效工具。