一种海洋几丁质酶产生菌的筛选及酶学性质研究

海洋是自然界几丁质主要来源地，滋养出种类繁多可降解几丁质的微生物，因此从海洋中筛选产高活性几丁质酶的细菌，是获得高产几丁质酶微生物的有效途径。该文以胶体几丁质为唯一碳源，从渤海滩涂筛选到一株具有降解几丁质特性的细菌Y-8,对其进行鉴定并研究其几丁质酶酶学性质。Y-8菌株经分子鉴定为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),发酵上清液经SDS-PAGE及蛋白质谱分析，发现其存在2种几丁质酶，分别为Chi1几丁质外切酶，氨基酸残基数为848,理论分子质量为87.6 kDa; Chi2几丁质内切酶，氨基酸残基数为1 054,理论分子质量为112.9 kDa。Y-8所产生的几丁质酶能够高效降解胶体几丁质，获得单一产物N-乙酰氨基葡萄糖，其最适反应温度为55℃,45℃保温1 h,仍能保持70%以上活性；最适pH为6.0,在pH 4.0～9.0、37℃保温1 h后相对酶活性保留55%以上，具有较好的稳定性。10 mmol/L的Mn²⁺能使几丁质酶活性提高362%,而EDTA以及SDS、吐温-20、吐温-80对酶活力具有抑制作用。     

产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株筛选、鉴定与酶学性质的初步研究

从上海浦东新区新场镇某农场种植田筛选出1株高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,初步研究其酶学性质,以获得有良好热稳定性和pH稳定性的酶。通过形态学特征、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列比对分析,确定该菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans),命名为P.macerans TLLY7。酶学性质测定结果表明,该酶的酶活性为1.35 U/mL,其最适反应温度为50℃、最适反应pH值为6.0,并且在40~45℃、pH 6.0~9.0稳定性良好。Ca²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺对酶表现出促进作用,Fe²⁺、Cu²⁺和Co²⁺则对该酶表现出抑制作用。其中Ca²⁺对酶的促进作用最强,酶活性促进率为25%,Cu²⁺对酶的抑制作用最强,酶活性抑制率为33%。K⁺、Mg²⁺对酶活性的影响较小。菌株TLLY7所产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质初步研究表明其具有深入研究的价值和应用的潜力。     

黑曲霉H1-9b 葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b 菌丝体,经pH5.7 磷酸缓冲液抽提获得粗酶液,粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200 凝胶过滤层析,得到葡萄糖氧化酶纯品。该酶的比活力为30569.7U/mg,回收率为30.2%,提纯倍数为41.4 倍,分子质量为94.1kD,为单亚基酶。该酶最适温度为37℃,最适pH 值为5.7,在30～40℃温度范围内稳定性较好,在pH4.0～8.0 范围内活性稳定。以不同浓度葡萄糖为底物在最适条件下测得该酶K_m 值为30.69mmol/L,V_max 为21.88μmol/L。Ag^+、Cu²⁺、Zn²⁺ 对该酶活性有较大抑制作用。结果表明,该酶稳定性较好,有一定的应用价值。     

谷氨酸棒杆菌硫酯酶基因NCgl1600的异源表达及酶学性质研究

硫酯酶在脂肪酸合成中具有解除脂酰CoA的抑制及提高脂肪酸产量的作用。因谷氨酸棒杆菌具有脂肪酸合成潜力，故文章以具有脂酰CoA硫酯酶活性的基因NCgl1600作为研究对象，通过异源表达基因NCgl1600获得其表达产物硫酯酶TesB并研究其酶学性质。通过测定底物特异性发现其对C8脂肪酰基CoA底物活性最高，最适温度为30℃，最适pH值为8.0，金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和K⁺对其酶活产生抑制作用，米氏常数K_m为56.81 mmol/L。     

海洋来源低温果胶酶产生菌筛选、鉴定与酶学性质研究

目的：从海洋底泥样品中筛选能低温降解果胶的新颖菌株,发掘具有潜在产业化价值的果胶酶。方法：以果胶为唯一碳源,利用透明圈法和3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)从大连渤海湾海泥中筛出一株高产果胶酶菌株。对其进行形态学、生理生化特征分析以及16S rDNA序列测定,BLAST同源基因比对后构建系统发育树,并进一步研究其酶学特性。结果：筛选高产果胶酶菌株命名为LY-1,通过16S rDNA序列分析并结合生理生化鉴定确定该菌株为橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)。菌株LY-1在25℃、180 r/min的条件下培养至24 h时,果胶酶的酶活力为30.56 U/mL。最适酶p H为8.0,最适酶温度为20℃。此外,该酶在60℃孵育2 h仍保持70%以上的酶活性,在pH7.0～9.0范围内稳定性良好,酶活性稳定维持在90%以上。金属离子Cu²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Co²⁺促进该酶活性,Mn²⁺、Zn...     

石屏臭豆腐来源的高产蛋白酶菌株筛选及酶学特性研究

目的:通过石屏臭豆腐产蛋白酶优势菌株发酵获得高产蛋白酶菌种资源。方法:采用单因素和响应面试验对培养基及发酵条件进行优化;以酪蛋白为底物,利用酶学技术探究了温度、pH、金属离子、有机化学试剂对JX-11菌株蛋白酶活性和稳定性的影响。结果:从石屏臭豆腐中分离1株高产蛋白酶的优势菌JX-11,经鉴定为彭尼普尔金黄杆菌(Chryseobacterium pennipullorum)。JX-11菌株最优产酶条件为温度23.0℃、葡萄糖添加量6.7 g/L、蛋白胨添加量15.0 g/L、pH 6.4,该条件下所产蛋白酶酶活力为(39.16±3.24) U/mL。JX-11菌株产蛋白酶的最适温度为30℃,在10～40℃范围内具有良好的稳定性;最适pH为7.0,在pH 6.0～9.0范围内具有良好的稳定性;Mn²⁺可显著提高JX-11蛋白酶的活性,相对空白组酶活力提升了4.33倍;Zn²⁺、Cu²⁺、K⁺均抑制该酶活性,Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺无显...     

植物乳杆菌漆酶的酶学性质及其对生物胺的降解作用

为研究乳酸菌来源的漆酶酶学性质及其在生物胺降解中的应用潜力,以来源于植物乳杆菌的漆酶编码基因为研究对象,对其进行异源表达及酶学性质的研究,测定其最适温度和pH值、金属离子及螯合剂对漆酶活性的影响、重组漆酶对不同体积分数的乙醇的耐受性以及重组酶对生物胺的降解作用。结果表明,重组漆酶最适温度为40℃,最适pH值为4.0;低浓度的Mg²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺对重组漆酶活力具有不同程度的促进作用,其中Zn²⁺和Ca²⁺的促进作用最为明显;反之,高浓度的Mn²⁺、Fe²⁺和乙二胺四乙酸能够抑制重组漆酶活力至原本的15%甚至更低;2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为底物时重组酶的米氏常数为2.49 mmol/L,最大反应速率为0.22 mmol/(L·min);重组漆酶对低体积分数乙醇具有很好的耐受性,在含有20%乙醇的体系中保存1 h后相对酶活力仍可达75%以上。生物胺降解实验表明,重组漆酶对酪胺和色胺的降解率达到了100%,对亚...     

海洋源蛋白酶产生菌筛选及酶学特性的初步研究

从海洋源鱿鱼中筛选高产蛋白酶菌株。通过检测蛋白酶产生水解圈结合蛋白酶活性测定的方法筛选高产蛋白酶菌株,采用PCR技术对筛选菌株进行16S rRNA鉴定,并构建目的菌株的系统发育树,同时研究粗蛋白酶的酶学特性。结果表明:筛选得到的10株产蛋白酶活力较高的菌株,经鉴定分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。其中SW5菌株产酶活性最高达257.67±2.44 U/mL,为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株所产粗蛋白酶的酶学特性研究发现,其最适pH为8.0,最适温度为40℃,终离子浓度为1 mmol/L时Mn2+、Ba2+和Ca2+对该蛋白酶活性有较高的激活作用,而Fe~(2+)和Zn~(2+)能明显抑制该蛋白酶活性。     

耐热嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在毕赤酵母中高效表达及酶学性质研究

甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶的蛋白质分子质量约为67 kDa。最适pH值和温度分别为4.0和65℃,在pH 2.0～6.0具有较强的稳定性,孵育1 h后仍具有80%的活性,且在20～65℃时,残留酶活力均能达到90%以上。1 mmol/L Co²⁺、脲和5 mmol/L SDS、Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺对TaMan5A的活力都有不同程度的激活作用。由于玉米秸秆富含纤维素与半纤维素,因此进一步确定了TaMan5A水解秸秆的最佳组合条件(玉米秸秆用量0.5 g, TaMan5A用量0.5 g, pH 4.0,水解2 d),并得到玉米秸秆用量和TaMan5A用量对玉米秸秆降解效率影响最大。该研究首次从棘孢木霉ND-1中克隆出...     

木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

研究了木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质。以缓冲液从木薯块根中获得粗提酶液,粗酶酶活力为9.37 U/g木薯干重;再分别通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.14 U/g木薯干重,经纯化β-葡萄糖苷酶纯度提高了14.62倍,总活力回收率为12.14%,电泳测得其分子量约70 kDa。该酶米氏常数K_m为3.60 mmol/L,V_max为12.36μmol/(min·mg protein);其最适pH为7.0,pH在6.0～8.0之间有较好的稳定性;在40℃以内有良好稳定性,在4℃存放30 d酶活力剩余81.78%。Mn²⁺和K⁺对酶有一定的促进作用,Al³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、尿素和SDS对酶没有显著影响(P>0.05),而Fe³⁺、F...     

黑曲霉脂肪酶Lip A的异源表达与酶学性质分析

脂肪酶在油脂分解和脂质合成方面具有广泛应用，是一种很有前途的生物催化剂。该研究对来源于黑曲霉的脂肪酶Lip A进行了异源表达及催化特性研究。结果表明，该重组脂肪酶的最适温度为50℃,最适pH为8.0,并且在40～60℃和pH 5.0～8.0有较好的稳定性。该酶对有机试剂有较好的耐受性，金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对脂肪酶水解活性有促进作用，Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺严重抑制该酶活性。反应动力学参数表明，对硝基苯酚乙酸酯是脂肪酶Lip A的最适底物，其反应K_m为(0.228±0.05) mmol/L,催化常数K_cat为(0.023±0.001) s^-1。生物信息学分析表明，脂肪酶Lip A是abH23同源家族Rhizomucor mihei脂肪酶中的一员。黑曲霉脂肪酶Lip A具有催化乳酸和乙醇生成乳酸乙酯特性，为其在酿造领域的应用奠定了基础。     

曲霉来源果胶裂解酶PnlF的克隆表达及酶学性质分析

果胶裂解酶是一类通过β-消除机制降解果胶的多糖裂解酶，对果胶的利用具有重要意义。该研究利用真核表达载体，克隆表达了来自曲霉属Aspergillus costaricensis的酸性果胶裂解酶PnlF,经过亲和层析和凝胶过滤层析对该酶的发酵液进行了分离纯化，并对其酶学性质和降解果胶的产物进行了系统性研究。该研究成功实现了PnlF在毕赤酵母中的分泌表达，粗酶活力达到526 U/mg。PnlF的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0;其酶活力在20～30℃及pH 5～6内稳定。Ca²⁺和Mg²⁺可以大幅度提高PnlF的活力；而Ag⁺和Cu²⁺则会严重抑制其活力；此外SDS、TritonX-100、苯甲磺酰氟等化学试剂对该酶活性的抑制作用较强。     

海洋细菌L1-9菌株蛋白酶的初步纯化及其酶学性质研究

采用硫酸铵沉淀的方法对海洋细菌L1-9菌株产生的蛋白酶进行了初步纯化并对酶学性质进行了测定.结果表明,硫酸铵饱和度由30%升高到80%,随着浓度的增加,沉淀的蚩白酶活性逐渐增强,硫酸铵饱和度为80%时,酶活性达到最高为128.3 U/mL.而上清液的酶活性随着硫酸铵饱和度的增加而下降.对该菌株蛋白酶的酶学性质的研究结果表明:该酶最适反应温度为40℃,在50℃以下保温20min酶活仍较高,在60℃以上酶活减弱:酶反应最适pH值为7.0,酶活性在pH值5.0～7.0时比较稳定,而在4.0＞pH＞9.0时酶活性下降较快:金属离子(5mmol/L)Na+、K+能提高蛋白酶活性,Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe3+对蛋白酶活性有抑制作用.     

超声波条件下蒜氨酸酶性质研究

对新鲜大蒜中的蒜氨酸酶进行分离、纯化,研究超声波条件下已纯化的蒜氨酸酶的酶学性质。研究结果表明,最佳超声波作用条件为频率135 kHz、功率110 W。在该条件下,蒜氨酸酶的最适温度35℃,最适pH 6.5,在20～40℃温度范围酶活性较稳定;Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+对蒜氨酸酶的活性有激活作用,K+、Mg2+、Cu2+抑制酶的活性;0.025 mmol/L外源PLP和0.5 mmol/L L-半胱氨酸对蒜氨酸酶的活性有促进作用。     

猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。     

酶法水解大豆异黄酮

利用Absidiasp R菌株 ,通过液体发酵 ,得到了一种高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶 ,该酶水解糖苷型大豆异黄酮的最适底物浓度为 7 5mg/mL ;最适反应时间为 1 5h ;该酶在温度为 2 0～5 0℃、pH为 4 0～ 7 0范围内相对稳定 ,最适酶解反应温度为 40℃ ,最适pH值为 5 0 ;金属离子对该酶活力的影响不显著 ,其中Co2 +、Zn2 +对该酶有激活作用 ,Ag+、Cu2 +对该酶有抑制作用 ,Fe3+浓度<5 0mmol/L时 ,对该酶有促进作用 ,当离子浓度 >5 0mmol/L时 ,则有抑制作用。利用实验获得的最适酶解条件反应 ,可使染料木苷生成染料木素的转化率达到 1 0 0 %。     

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶(ADI)进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30~40℃和p H5.5~7.5时较稳定。不同浓度的Zn2+对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu2+对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化

目的获取活性高的重组SOD 1/3杂合酶。方法用含pET-SOD 1/3的工程菌诱导表达重组SOD 1/3杂合酶,通过分析SDS-PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、Cu 2+、Zn 2+浓度对重组酶表达量和活性的影响。结果正交试验表明,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在A600=1.2时诱导,Cu2+、Zn2+浓度分别为2.4 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间12 h,能获得高活性重组SOD 1/3,其比活性为1681U/mg。结论培养温度和Cu2+、Zn2+浓度是优化表达的最主要因素。降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加Cu2+、Zn2+能促进重组酶活性提高。     

高产酸性β-葡萄糖苷酶的优良本土酵母菌株筛选、鉴定及酶学性质分析

为获得高产酸性β-葡萄糖苷酶及对葡萄酒生境耐受性良好的本土非酿酒酵母菌株,该文从452株本土非酿酒酵母菌株中通过逐步分析菌株发酵力、耐受性、高产β-葡萄糖苷酶能力和粗酶液的酶学性质,筛选目标酵母菌株。结果表明,452株非酿酒酵母菌株中72 h的CO₂失重量>0.51 g/100mL的菌株有221株;高产β-葡萄糖苷酶的菌株34株;菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370对葡萄糖、SO₂、酒精度和pH值均具有较好的耐受性,分别能耐受高糖350 g/L、酒精3%～6%（体积分数）、SO₂ 250 mg/L和低pH值2.5;其中菌株GC204、NM218、BF345均具有较高的β-葡萄糖苷酶活力,分别为54.34、49.5、46.42 mU/mL。酶学性质分析表明,菌株NM218和BF345中的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃,最适pH值为4.0;浓度为5 mmol/L的Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe^3+<...