林可霉素生物合成基因lmbU的敲除及其遗传回补

利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensis NRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensis JLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力.利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成能力.单一回补下游基因lmbY和lmbX不能使缺陷株重新恢复林可霉素合成能力;而同时回补lmbU基因和下游基因lmbY和lmbX却能回补这种缺陷,缺陷株林可霉素合成能力的丧失不仅是由下游基因的破坏而引起,证实了lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因.根据不同重组质粒上装载的基因片段性质推测了lmbU基因可能的启动子.     

一种简便快速筛选重组子的方法

将转化后的单菌落置于快检缓冲液中,振荡后,直接通过琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小,2h内可筛选出重组子．详细介绍了快检缓冲液配方、快检效果、注意事项以及与其它方法的优势比较．     

致弱I型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ｉ型马立克病病毒（ＭＤＶ）感染的细胞基因组ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ酶切产物建于ｐＵＣ１８质粒载体文库中,以ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ标记的含有中毒ＧＡ株ＭＤＶｐｐ３８基因克隆片段作为探针,进行了原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用ＥｃＲＩ酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组ｐＵＣ１８质粒,序列人析表明该ｐｐ３８基因同源物与ｐｐ３８基因有极高的同源性,仅有１个碱基突变并导致１个氨基酸的夫     

致弱Ⅰ型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)感染的细胞基因组DNA的EcoRⅠ酶切产物建于Puc18质粒载体文库中,以digoxingenin标记的含有强毒GA株MDV pp38基因克隆片段作为探针,进行原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用EcoRⅠ酶切分析筛选到含pp38基因同源物的重组Puc18质粒. 序列分析表明该pp38基因同源物与pp38基因有极高的同源性,仅有1个碱基突变并导致1个氨基酸的替换.     

重组真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中的表达

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种理想的真核蛋白表达系统．将真菌细胞色素P450nor2基因亚克隆到酵母表达载体pAUR123中,构建重组表达质粒pAUR-P450nor2并转化酿酒酵母AH22,经Aureobasidin A筛选和菌落PCR鉴定得到阳性克隆．SDS-PAGE分析证实：重组的真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中实现了高表达．     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌

目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌.方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pllac的lac启动子下游,得到质粒pllac-pZP3α.将质粒pllac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5 μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中.筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失.结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pllac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌.结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达.     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源DNA片段的克隆

利用作者克隆的酿酒酵母基因启动子片段Ｙ８为探针和菌落原位杂交方法，从构建的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＮＮ２７基因组文库中共筛选８个阳性克隆。根据这些克隆中插入片段大小和限制酶切结果，可将其划分为６种，分别命名为ＹＮ１－ＹＮ６．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这６种ＤＮＡ片段不仅能与６．５ｋｂ的全长Ｙ８探针我，而且均能与ＰｓｔＩ酶切Ｙ８所得的３段ＤＮＡ探针杂交。     

紫云英根瘤菌结瘤基因调控片段克隆和分析

通过对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其Ｎｏｄ－突变株７６５３Ｒ－１侵染根毛试验证实,７６５３Ｒ菌株３１８×１０３ｂｐ大质粒决定早期结瘤功能,分子杂交结果显示,其ｎｏｄＤＡＢＣ定位于该质粒上．将７６５３Ｒ菌株的大质粒ＤＮＡ进行酶切并克隆到表达载体ｐＭＰ２２０上,构建ｌａｃＺ重组子文库,将ｌａｃＺ重组子文库导入７６５３Ｒ菌株,在加有Ｘ－ｇａｌ和种子浸提物的根瘤菌培养基上选择蓝色菌落．通过Ｍｉｌｅｒ试验测定它们的β－半乳糖苷酶活性,获得１株种子浸提物对其有诱导效应的菌株ＨＮ１８,对该菌株所含的重组质粒ｐＨＮ１８进行ｎｏｄＤＡＢＣ探针杂交,发现有１条１．７×１０３ｂｐ的阳性杂交带,说明在ｐＨＮ１８中克隆有结瘤基因启动子     

我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析

设计一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’，下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆了来自我国甘肃、青海和云南地区牦牛β乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，甘肃牦牛与青海牦牛该序列的核苷酸同源性为98、13％，与云南牦牛该序列的核苷酸同源性为97．65％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．45％。     

高质量蛋白质空间结构数据库的构建方法

根据不同的研究需要,提出了不同的建库标准。在以分辨率为主要选择依据的基础上,采取综合的打分的方法,全面地衡量一个序列质量的高低。引入同一性因子Ｓ,找到了序列的同一性Ｓ和序列同源性Ｖ的关系,从而在判别序列之间同源程度时由序列的同一性因子Ｓ取代序列同源性参数Ｖ。     

一个新的同系线性因子

本文提出了一个新的同系线性因子，其表达式为：ｆ（ｎ，ｋ）＝（ｋ＋１）（ｎ＋１）／（２Ｎ＋３）．用有机化合物共轭体系和非共轭体系的光电子能谱数据对该同系线性因子进行了检验．     

Sequencing of p35 gene fromHeliothis armigera polyhedrosis virus and its homologous comparison

Using p35 gene primers of AcNPV, about 1 kb fragment was obtained by PCR from HaNPV DNA and was sequenced thereafter. It has a full reading frame encode 299 amino acids. Sharing identity of 94% in nucleotides and 84% in predict amino-acids with AcNPV, a apoptosis inhibiting gene was found. According to comparison of p35 genes in five kinds of baculovirus, it is found that AcNPV, TnNPV and BmNPV share the most intimate blood relation. HaNPV is near the above three species. LsNPV is little remote from them. This result reconfirmed those we have done with gp37 genes and vp39 genes. It is more accurate to use conserved gene for species division than that of the serological identification. Biography: WANG Ye-fu(1962-), male, Ph D.     

毛细管反相电色谱中电渗流测定方法的研究

根据反相高效液相色谱中同系物保留值的碳数规律,通过迭代分析的方法测定了毛细管电色谱中的电渗流速率,并与一般的测定方法加以比较,探讨了影响电渗流速率测定结果的可能原因。     

中国人卵母细胞中联会复合体的电镜分析

运用表面铺展SDS处理,硝酸银染色的电镜观察技术,分析了5例中国胎儿卵母细胞中联会复合体的发育情况,结果表明：引起神经管损伤的因子对卵母细胞中同源染色体配对行为无影响;中国人卵母细胞中同源染色体开始配对可能发生在胎龄14周之前。     

同源蛋白质等电点的预测

应用一个依据蛋白质氨基酸组成可预测其等电点(pI)的数学模型,辅以自行设计的计算程序,计算了弹性蛋白酶(Elastase)、牛胰乳蛋白酶原(Bovine chymotrypsinogen)和α-胰凝乳蛋白酶(α-Chymotrypsin)的pI,计算值同实测值基本吻合。应用该模型还给出了4种精氨酸酶(Arginase)同功酶的pI理论预测值。     

萘电子光谱的精细结构及同系线性表征

利用高分辨率的DMS-300UV-Vis光度计,于乙醇溶液中得到了萘的β带的精细光谱。给出骈苯系β带的3条同系线,回归出β_I,β_(II)的■与同系序数n的定量关系,其γ分别为0.9999,1.0000,并证明这是一组邻同系峰。同时预测了骈苯系β带中一些未知峰的可能波长。