实时荧光PCR法检测食品中亚利桑那沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是食品检测过程中最常见的致病菌之一,亚利桑那沙门氏菌（Salmonella arizonae）又是沙门氏菌中比 较难鉴定的亚种。该实验通过实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法快速准确的检测亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌。根据GenBank 公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gud D基因序列, 分别设计引物和Taqman探针。 使用10株不同血清型的沙门氏菌标准菌 株、88株沙门氏菌分离株和29株食品中常见食源性致病菌进行实时荧光PCR特异性实验。结果显示,该实验所设计的引物探针特异 性非常好。 实时荧光PCR灵敏性试验结果表明,检测灵敏度可达到1～10 CFU/mL的添加浓度。 经模拟污染样品验证,所建立的实时 荧光PCR方法与传统方法的检测结果相一致,具有检测周期短、操作简便的优势。     

四重荧光定量PCR法鉴定肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌

目的建立四重荧光定量PCR体系鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。方法针对沙门氏菌属特异性ompC基因、肠炎沙门氏菌sdf基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4495和伤寒沙门氏菌STY2021序列设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究。结果 28株不同血清型的沙门氏菌均扩增出ompC基因,其他13株非沙门氏菌均未出现ompC的非特异性扩增。sdf、STM4495、STY2021的探针和引物分别特异性扩增出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌,而25株其他血清型沙门氏菌以及13株非沙门氏菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系的最低检测限分别为48 pg/mL(ompC)、560 pg/mL(sdf)、530 pg/mL(STM4495)、35 pg/mL(STY2021)。结论该方法特异好、灵敏高、能够快速检测沙门氏菌并鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。     

预包装柳州螺蛳粉沙门氏菌实时荧光PCR快速检测

目的建立实时荧光PCR法快速检测预包装柳州螺蛳粉中沙门氏菌的分析方法。方法根据沙门氏菌invA基因设计引物和探针,优化反应体系中的探针浓度后对人工添加沙门氏菌和干扰菌模拟受污染的预包装柳州螺蛳粉样品进行检测。结果设计的引物和探针只对阳性菌株有荧光反应,具有良好的特异性,最佳反应探针终浓度为0.2μmol/L,检测灵敏度为100CFU/mL,扩增效率103.92%;对模拟污染的预包装柳州螺蛳粉经过一步增菌18 h后最低能检测出4 CFU/25 g沙门氏菌。结论实时荧光PCR检测灵敏度高、特异性强,可应用于预包装柳州螺蛳粉中沙门氏菌的快速高效检测。     

实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌

建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。     

3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

目的建立多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)法检测3种常见血清型沙门氏菌的分析方法。方法以肠炎沙门氏菌Hat基因、鼠伤寒沙门氏菌Stm-4495基因、乙型副伤寒沙门氏菌sdfI基因设计合成特异性引物,提取沙门氏菌基因组DNA为扩增模板,验证引物特异性,优化多重PCR退火温度及引物浓度,检测方法特异性及检出限,并利用该方法对人工污染冷鲜鸡肉进行检测。结果 3对引物特异性强且无交叉影响;25μL多重反应体系中,引物STM、HAT、SDF最佳终浓度分别为:0.5、0.5、0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃;11株阴性对照菌无目标条带检出,方法特异性良好,以3种血清型沙门氏菌纯培养物DNA混合物为模板,检出限低至DNA质量浓度1 pg/μL;人工污染鸡肉经过12 h增菌,能同时检测出3种血清型沙门氏菌的检测限为:肠炎沙门氏菌(4.0±1.0) CFU/g、鼠伤寒沙门氏菌(8.0±0.9) CFU/g、乙型副伤寒沙门氏菌(8.0±0.6) CFU/g。结论本方法特异性强、检测限低,对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测具有重要意义。     

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。     

免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合实时荧光PCR(real time PCR)快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR(IMS-real time PCR)方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×10~1 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×10~2 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×10~2CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

Taqman MGB PCR定量检测水产品中沙门氏菌的方法建立

建立采用Taqman MGB实时荧光PCR法快速定量检测水产品中沙门氏菌。根据沙门氏菌fimY基因保守序列,设计引物和Taqman MGB探针,建立Taqman MGB实时PCR定量检测体系。采用本方法对24株共14种血清型沙门氏菌和17株与沙门氏菌亲缘关系比较近,以及在样品中能同时存在的常见食源性致病菌菌株进行PCR扩增。结果显示：所有的沙门氏菌菌株结果均为阳性,而非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性,反应特异性为100%。本方法的纯菌最低检测低限为13CFU/ml,样品江瑶贝和蚬子肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为130CFU/ml;香螺肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为1300CFU/ml。定量关系式为y=－3.381418lnx+45.115715,R2= 0.964878。整个实验2h即可完成,可应用于水产品中沙门氏菌污染状况调查及快速检测。     

磁分离结合qPCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌

验证噬菌体磁分离结合实时荧光定量聚合酶链式反应,快速检测方法对食品中沙门氏菌的检测效果。以一株鼠伤寒沙门氏菌的特异性噬菌体T102为分子识别元件,首先将其与羧基化磁珠偶联,制备获得噬菌体磁性颗粒（Phage T102 Magnetic Beads）复合物,利用噬菌体磁性颗粒复合物从食品中特异性分离富集沙门氏菌,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测富集后的沙门氏菌。该沙门氏菌快检方法检出限为100 CFU/mL（0.1 CFU/PCR）,线性范围为1×102~1×109 CFU/mL,变异系数2.1%,特异性强,检测时间为6 h。实验选取300批食品安全抽检样品与GB 4789.4-2016标准《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行比对,均未检出阳性样品,结果一致。该方法可为噬菌体偶联纳米磁珠在食源性致病菌检测领域的应用提供参考依据。     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

PCR法检测肉鸭屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染

为建立肉鸭加工中快速、准确的沙门氏菌PCR 检测方法,并应用于肉鸭屠宰生产加工链沙门氏菌的实时监测。采用Primer Premier 5.0 软件针对沙门氏菌特有的fimY 基因设计合成一对引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′,并对沙门氏菌DNA 扩增PCR 体系的退火温度、引物浓度、Mg2+ 浓度和聚合酶浓度进行优化。结果表明：成功扩增出沙门氏菌标准株和分离株的2 7 5b p 目的片段,灵敏度达到了1.2pg;应用建立的PCR 方法对国内某典型肉鸭屠宰厂的肉鸭屠宰链环节进行沙门氏菌污染的检测,发现在屠宰环境、拔毛浸烫水、浸蜡冷却水、清洗池水、宰前毛、食道、粪便和沥水体腔内共有25 个样品中扩增出了275bp大小的特异性片段,而空白对照无扩增条带。     

Combination of immunomagnetic separation with real-time PCR for rapid detection of Salmonella in milk, ground beef, and alfalfa sprouts

A rapid, specific, and sensitive method for detecting Salmonella spp. in pasteurized milk, ground beef, and alfalfa sprouts was developed. The method combined immunomagnetic separation with a real-time PCR assay based on the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. The primers used produced a product with a melting temperature of 87+/-0.5 degrees C during the PCR assay by amplifying a 284-bp sequence from the invasive gene (invA) of Salmonella. The method was successful in detecting 20 Salmonella strains, but the expected PCR product was not formed by any of 11 other bacterial strains. To test this combined method for the monitoring of Salmonella, Salmonella enterica serotype Newport was inoculated into 52 samples each of pasteurized milk, ground beef, and alfalfa sprouts. Following a 10-h nonselective enrichment step in buffered peptone water, cells were removed by immunomagnetic separation and DNA extracted using the High Pure PCR template preparation kit. The DNA produced was used as a template in the real-time PCR assay. When spiked pasteurized milk, ground beef, and alfalfa sprout samples were analyzed by this protocol, an initial inoculum of 1 CFU/ml, 25 CFU/25 g, and 1.5 CFU/25 g, respectively, was detectable within 13 h. These results indicate that the combination of immunomagnetic separation and real-time PCR assay was a highly specific and sensitive method for the rapid detection of Salmonella.     

乳制品中沙门氏菌分子检测方法的验证研究

目的验证沙门氏菌、非沙门菌及阳性核酸模板对MICROFAST?沙门氏菌核酸检测试剂盒(PCR-探针法)的特异性和稳定性,同时比对试剂盒法与GB 4789.4—2016培养法定性检测结果的一致性。方法用实验室保存的30株沙门氏菌和15株非沙门氏菌菌株验证MICROFAST?沙门氏菌核酸检测试剂盒(PCR-探针法)的特异性。通过人工添加不同浓度沙门氏菌对30个乳制品样本,采用国家标准法和试剂盒法同时检验,探究方法的一致性。选择制备好的5份阳性核酸模板,每个模板分别使用3个批次的试剂盒进行检测,对实验结果进行重复性和显著性分析,确定不同试剂盒批次间是否存在显著性差异。结果 30株沙门氏菌菌株和15株非沙门氏菌菌株的特异性检测结果表明,MICROFAST?沙门氏菌核酸检测试剂盒(PCR-探针法)对沙门氏菌的特异性符合预期。人工添加的阳性样本检测结果表明,在乳制品样本范围内,试剂盒的假阳性率与假阴性率为0。3个批次的试剂盒对5份阳性模板检测结果之间没有显著性差异,变异系数CV均小于1%。结论该试剂盒方法与国家标准法相比,具有操作简单、快速等优势,适合乳制品加工过程微生物快速检测。     

能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定

目的验证国标法和实时荧光定量PCR法2种方法对能力验证中的沙门氏菌双相亚利桑那亚种分离与鉴定的效果。方法按照作业指导书要求及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的方法分离菌株,以实时荧光定量PCR仪对分离菌株进行快速筛查,再将生化鉴定结果符合沙门氏菌特征的菌株进行血清学鉴定。结果样品CODE 0575在沙门氏菌显色平板上分离得到蓝绿色圆形菌落,在BS平板上分离得到灰绿色圆形菌落,经实时荧光定量PCR仪快速筛查,结果为阳性;再通过VITEK 2 compact鉴定为肠道沙门菌双相亚利桑那亚种;该菌不产硫化氢,ONPG为阳性,确定血清型为60:r:e,n,x,z15。结论以国标法为基准,借助实时荧光定量PCR仪和VITEK 2全自动鉴定系统进行检测,可确保沙门氏菌双相亚利桑那亚种不被漏检;应特别注意沙门氏菌双相亚利桑那亚种在显色培养基上与常见沙门菌表型不一致;建议扩大对沙门氏菌双相亚利桑那亚种的监测范围。     

全基因组测序和real-time PCR法检测食源性沙门氏菌parC、gyrA基因突变特征

以45 株食源性沙门氏菌喹诺酮耐药株为对象,采取全基因组测序和实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）法检测parC、gyrA基因突变位点,并对检测方法可靠性、耐药基因突变特征进行评估和分析。首先将4 株沙门氏菌进行二代全基因组测序,根据测序数据分析结果,建立了一种real-time PCR法检测gyrA Asp87Tyr、gyrA Asp87Asn、parC Thr57Ser和parC Ser80Ile这4 个突变位点。将沙门氏菌进行qnrS、qnrA、qnrB的real-time PCR检测,发现有31 株菌未检出qnr基因。以这31 株菌为对象,采取real-time PCR法筛查基因突变位点,结果发现parC Thr57Ser和gyrA Asp87Asn型突变最常见。将real-time PCR阳性的10 株菌扩增parC、gyrA基因全长并测序,real-time PCR检测和测序结果完全吻合,说明了real-time PCR检测的可靠性。全基因组测序和real-time PCR法相结合的方法用于耐药基因突变筛查,既可以发现新的基因突变,又可以快速筛查大样本的主要突变类型,可作为沙门氏菌耐药性研究的一种可靠手段。     

TaqMan探针法实时荧光定量PCR快速检测沙门菌的探讨

为建立一种快速、灵敏、特异的实时荧光定量PCR法用于沙门菌的检验，根据GenBank上登录的编号为AE016841的沙门菌序列，应用生物学软件在fimY基因的保守区设计引物和TaqMan探针，同时应用BLAST程序进行网上序列比对，并进行筛选、优化。用鼠伤寒标准菌和60份食品样本进行本检测方法的特异性、敏感性和重复性试验，并与常规法和科玛嘉平板分离法做比较。本方法对沙门菌的检测具高度的特异性，检测的灵敏度这102CFU／ml，从增菌至完成检测仅需24h左右，是一种快速检测沙门菌的敏感、特异的新方法。     

Rapid, specific detection of Salmonella Enteritidis in pooled eggs by real-time PCR

An assay was developed for the specific detection of Salmonella Enteritidis in eggs with the use of an application of the fluorogenic 5' nuclease assay (TaqMan). In this assay, a segment of the gene sefA specific to Salmonella group D strains such as Salmonella Enteritidis was used. The amplification of the target gene products was monitored in real-time by incorporating a fluorescent dye-labeled gene-specific probe in the PCR reaction. This method correctly detected and distinguished Salmonella Enteritidis from nearly 50 of non-group D Salmonella and other non-Salmonella strains. Detection of the sefA gene was linear for DNA extracted from approximately 10(2) to 10(9) CFU/ml in phosphate-buffered saline and 10(3) to 10(8) CFU/ml in raw egg. In two trials, when applied to detection of Salmonella Enteritidis in homogenized egg pools and compared with conventional culture methods, the newly developed PCR method yielded a 100% correlation with results obtained by a conventional culture method. However, the PCR method required only 2 days, compared to the 5 days required by the culture method. The sensitivity of this assay was approximately less than 1 CFU/600 g of egg pool. The real-time PCR assay proved to be a rapid, highly sensitive test for detection and quantification of low concentrations of Salmonella Enteritidis in egg samples.