中国脊髓灰质炎病毒中II17和中III2疫苗株部份基因序列的分析

对中国脊髓灰质炎ＩＩ型减毒活疫苗株－中ＩＩ１７和ＩＩＩ型减毒活疫苗株－中ＩＩＩ２和ＶＰ１段部份核酸片进行序列分析,并分别与相应的Ｓａｂｉｎ２和Ｓａｂｉｎ３株有关片段的核苷酸序列进行比较。在４１６个核苷酸序列中,中ＩＩ１７与Ｓａｂｉｎ２有９９．３％同源性,中ＩＩ２与Ｓａｂｉｎ３株完全一致。从我国服用国产活疫苗地区急性弛缓性订痹病例中分离到的部份２型疫苗株,分别与中ＩＩ１７和Ｓａｂｉｎ２相比较,发现与     

中国脊髓灰质炎病毒中Ⅱ_（17）和中Ⅲ＿2疫苗株部份基因序列的分析

对中国脊髓灰质炎Ⅱ型减毒活疫苗株──中Ⅱ１７和Ⅲ型减毒活疫苗株──中Ⅲ２的ＶＰ１段部份核酸片段进行序列分析,并分别与相应的Ｓａｂｉｎ２和Ｓａｂｉｎ３株有关片段的核苷酸序列进行比较。在４１６个核苷酸序列中,中Ⅱ１７与Ｓａｂｉｎ２有９９．３％同源性,中Ⅲ２与Ｓａｂｉｎ３株完全一致。从我国服用国产活疫苗地区急性弛缓性麻痹病例中分离到的部份２型疫苗株,分别与中Ⅱ１７和Ｓａｂｉｎ２相比较,发现与中Ⅱ１７株更为近缘,海南、山东、湖南株分别只有０、１或２个核苷酸的改变。     

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因特征及其神经毒力的初步观察

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株普遍存在基因变异的现象,如重组,点突变等。我们选出１０株有代表性的变异株,在具有人脊灰病毒受体基因的转基因小鼠ＰＶＲ－Ｔｇ２１中做毒力分析,发现Ｓａｂｉｎ １基因型与野毒基因型的重组株显示很强的神经毒力,其ＰＤ５０ｉｎＴＣＩＤ５０值为４．５,而Ｓｂｉｎ１标准株的ＰＤ５０值大于８０。另外两株Ｉ型疫苗株只有关键性核苷酸位点发生突变,只在位点５２５－发生突变的一株,其ＰＤ５０值为     

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析

从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒,在ＶＰ１编码区,经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定,并经核酸测序进一步证实力疫苗株,其中５株为Ｉ型疫苗,１６株Ⅱ型疫苗株,１１株Ⅲ型疫苗株,以同样的分析方法检测这些毒株基因组的３Ｄ聚合酶编码区,发现２株Ｉ型疫苗株在３Ｄ区的４３１个核苷酸序列为野毒序列,即这２株Ｓａｂｉｎ１基因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）重组株;其余３株Ｉ型疫苗株未发现基     

转基因小鼠用作脊髓灰质炎活疫苗神经毒力实验动物模型的研究

选用Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,３批活疫苗样吕（ＷＨＯ／Ⅲ参考制品,９３／３６３和３Ｊ两批猴体神经毒力实验不合格的疫苗）和１株标准强毒株（Ｌｅｏｎ）,脊髓内注入携带有人细胞脊髓灰质炎病毒受体基因的转基因小鼠（ＰＶＲＴｇ２１）。临床和组织病理学检查表明,Ｌｅｏｎ病毒的毒力极强,２．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０可使１００％小鼠麻痹和死亡,ＷＨＯ／Ⅲ疫苗参考制品毒力最弱,５．５ｌｏｇ１０ＣＩＤ５０才能使８１．７％小     

中国脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗相关分离株病毒性状的观察

对１９９４年中国分离的１３株脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗相关株进行了ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析,发现７株为重组病毒,毒力较疫苗株有回复,在Ⅱ型脊髓灰质炎病毒基因序列上,对于神经毒力有重要影响的第４８１位核苷酸发生突变,另一个被视为重要位点的２９０８位核苷酸无一发生变化,反而在２９０９位核苷发生了高频率的点突变,意味着２９０９位点在中国Ⅱ型疫苗相关株的自然变异中可能起着重要作用。     

重新评价G-480位点变异对I型脊髓灰质炎疫苗病毒神经毒力的影响

在对分离于中国贵州省的9株I型循环的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(cVDPVs)进行全基因组核苷酸序列分析后,发现已知最重要的决定病毒神经毒力的位点G-480和U-525并没有发生回复野生型突变;另外一些已知的神经毒力决定位点,如A-2438、A-2795、C-6203和G-7441等均已经发生了回复野生型突变。根据核苷酸序列的不同,从9株I型cVDPVs毒株中选取5株病毒感染转人脊髓灰质炎病毒受体基因的小鼠进行神经毒力实验,发现它们的神经毒力都有所升高,其中CHN8184株和CHN8229-1.1株的神经毒力已经十分接近P1/Mahoney株,CHN8229-1.1株、CHN8229-2株和CHN8229-3株神经毒力依次递减,但仍处于较高水平,在它们的全基因组中分别只有7个和2个核苷酸的差异,而毒力却相差很多,提示有新的未鉴别的神经毒力决定位点的存在。对这些毒株5′非编码区(5′NCR)的第V结构域进行二级结构预测,发现它们的二级结构很稳定。在G-480位点没有发生回复突变的情况下,部分毒株的神经毒力已经非常接近P1/Mahoney的水平,提示先前的研究中关于G-480突变对I型脊髓灰质炎病毒神经毒力的作用可能被估计过高,G-480位点不是唯一重要的神经毒力决定位点,可能多个核苷酸联合突变才能达到减毒的效果。要真正全面了解P1/Sabin株的减毒机制,还需要进行更加深入的研究。     

Ⅰ型脊髓灰质炎病毒壳蛋白肽图谱分析

脊髓灰质炎病毒三个血清型的野毒株与疫苗株的全基因序列业已测出,有学者比较发现,疫苗株病毒在减毒过程中有许多基因位点发生了突变。本文用单向肽图谱分析法,对Ⅰ型脊髓灰质炎病毒野毒株(Mahoney株)和减毒株(Sabin Ⅰ株)的外壳蛋白VP1,VP2,VP3分别作了比较分析。结果发现四个有差     

重新评价G-480位点变异对Ⅰ型脊髓灰质炎疫苗病毒神经毒力的影响

在对分离于中国贵州省的9株Ⅰ型循环的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPVs）进行全基因组核苷酸序列分析后,发现已知最重要的决定病毒神经毒力的位点G-480和U-525并没有发生回复野生型突变;另外一些已知的神经毒力决定位点,如A-2438、A-2795、C-6203和G-7441等均已经发生了回复野生型突变。根据核苷酸序列的不同,从9株Ⅰ型cVDPVs毒株中选取5株病毒感染转人脊髓灰质炎病毒受体基因的小鼠进行神经毒力实验,发现它们的神经毒力都有所升高,其中CHN8184株和CHN8229-1．1株的神经毒力已经十分接近P1／Mahoney株,CHN8229-1．1株、CHN8229-2株和CHN8229-3株神经毒力依次递减,但仍处于较高水平,在它们的全基因组中分别只有7个和2个核苷酸的差异,而毒力却相差很多,提示有新的未鉴别的神经毒力决定位点的存在。对这些毒株5′非编码区（5′NCR）的第Ⅴ结构域进行二级结构预测,发现它们的二级结构很稳定。在G-480位点没有发生回复突变的情况下,部分毒株的神经毒力已经非常接近P1／Mahoney的水平,提示先前的研究中关于G-480突变对Ⅰ型脊髓灰质炎病毒神经毒力的作用可能被估计过高,G-480位点不是唯一重要的神经毒力决定位点,可能多个核苷酸联合突变才能达到减毒的效果。要真正全面了解P1／Sabin株的减毒机制,还需要进行更加深入的研究。     

HCV非结构蛋白(NS2/NS3)基因表达载体的构建及其一级结构分析

应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,从ＨＣＶ感染者血清中扩增编码ＨＣＶ病毒蛋白酶的ＮＳ２－ＮＳ３ｃＤＮＡ片段,在其５′和３′端分别引入ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ限制性内切酶位点,定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建重组载体ｐｃＤＮＡ－ＮＳ２３,重组表达载体经限制性内切酶消化鉴定．用ＳＰ６和Ｔ７通用引物对目的基因片断进行序列分析．序列同源性分析结果表明,与ＨＣＶ－Ｊ、ＨＣ－Ｃ２有高度的同源性,与ＨＣＶ－１、ＨＣＶ－Ｊ６、ＨＣＶ－Ｊ８同源性差,提示所克隆的基因属ＨＣＶⅡ型．该区内重要的功能位点如Ｚｎ２＋依赖性金属蛋白酶催化中心、丝氨酸蛋白酶催化中心等均高度保守     

2010年山东省环境污水中脊髓灰质炎病毒的监测及其基因特征分析

本研究在山东省开展了脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的外环境监测,从济南、临沂两地采集污水标本,浓缩处理后进行病毒分离,对分离到的PV采用中和试验进行血清定型,并对其VP1及3D区进行序列测定,分析其基因突变和重组情况。2010年,共采集污水标本32份,PV阳性10份,阳性率31.3%;分离到18株PV(PV1型3株,PV2型9株,PV3型6株),均为疫苗相关株,VP1完整编码区核苷酸变异数在0~4个之间,在3株PV2型病毒和4株PV3型病毒的基因组中发现重组;对VP1区影响神经毒力的减毒位点分析发现,PV1型病毒中有1株在nt 2 749发生突变(A→G),PV2型病毒中有1株在nt2 908发生A→G突变,3株在nt2 909发生U→C突变,6株PV3型病毒全部在nt2 493发生C→U突变。环境污水中可以分离到PV,其基因重组率和主要减毒位点的回复突变率较高,未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

PCR法检测外环境水中脊髓灰质炎病毒I型基因的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测外环境水中分离的脊髓灰质炎病毒Ｉ型（ＰＶＩ）毒株基因型,发现所分离的２２株病毒,均为疫苗ＳａｂｉｎＩ相关株,脊髓灰质炎病毒的温度敏感（Ｔ特征）试验亦提示为弱毒标,与ＰＣＲ试验相吻合,表明实施强化免疫和常规免疫后,外环境中的脊髓灰质炎病毒已被疫苗相关株循环所取代,同时证实用了ＰＣＲ作为相环境中ＰＶＩ病毒株的基因型分析的检测方法是特异和敏感的。     

单纯疱疹病毒的PCR直接基因分型

本文利用ＰＣＲ技术建立一种对ＨＳＶ直接基因分型的方法。在ＨＳＶ－Ⅰ、Ⅱ两型的ＤＮＡ多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物（ＨＤＰ－Ｂ）和两条型特异的下游引物（ＨＤＰ－１、ＨＤＰ－２）。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在ＨＳＶ－Ⅰ产生５４３ｂｐ条带,ＨＳＶ－Ⅱ产生３７２ｂｐ条带,据此在基因水平上对ＨＳＶ进行分型。５株不同来源的ＨＳＶ（２株Ⅰ型,３株Ⅱ型）分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该     

对我国温州地区脊髓灰质炎病毒分离株抗原性差异的研究

对脊髓灰质炎（脊灰）病毒抗原性监测的结果表明,不同年份分离的毒株,其抗原性存在型内差异。对抗Ｓａｂｉｎ ｌ活疫苗血清中和脊灰病毒能力的实验研究发现：（２）要有效地中和流行野毒株,必需高价抗Ｓａｂｉｎ免疫血清;（２）对同一地区同一年份流行的野毒株,中和能力不尽相同;（３）对同一地区流行的野毒株,中和能力随毒株年份的迁延而呈下降趋势。这可能有助于部份解释近年来在脊灰流行中,全程活疫苗免疫者病例有所增中     

急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

PCR方法检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型野毒株的研究

用聚合酶链反应试验（ＰＣＲ）检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（ＰＶＩ）野毒株,仅需５μｌＰＶＩ细胞培养液,方法简便、快速、敏感、特异,用本法对我国１４个省市７９份ＰＶＩ分离株的检测结果,能与检定ｓａｂｉｎⅠ相关株的ＳＩ／ＰＣＲ法的检测结果相印证,与其中３１份核苷酸测序判断为野毒株的结果相一致。其检测阳性率为８４．４％,基本能检测我国流行过的５个ＰＶＩ基因型野毒株。另外,从检测结果看,除北京市未发现野毒株外,其它１３个省区都有野毒株流行,表明当前我国消灭脊灰的任务还很重。     

单纯疱疹病毒的PCR直接基因分型

本文利用ＰＣＲ技术建立一种对ＨＳＶ直接基因分型的方法。在ＨＳＶ－Ⅰ、Ⅱ两型的ＤＮＡ多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物（ＨＤＰ－Ｂ）和两条型特异的下游引物（ＨＤＰ－１、ＨＤＰ－２）。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在ＨＳＶ－Ⅰ产生５４３ｂｐ条带,ＨＳＶ－Ⅱ产生３７２ｂｐ条带,据此在基因水平上对ＨＳＶ进行分型。５株不同来源的ＨＳＶ（２株Ⅰ型,３株Ⅱ型）分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的ＤＮＡ不产生特异反应,敏感性可达１ｆｇ。应用该法对１５１份临床可疑ＨＳＶ感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。     

减蛋综合征病毒100K蛋白基因的克隆与序列分析

用常规方法提取减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株（ＡＡ２株）病毒ＤＮＡ,分别构建了限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＳｐｈⅠ、ＰｓｔⅠ水解片段的全基因文库,并对其中１００Ｋ蛋白基因的序列进行了分析。ＥＤＳＶ１００Ｋ蛋白基因位于减蛋综合征病毒基因组５５．７～６４．８物理图谱单位（ｍ．ｕ）,共２０９１个核苷酸（ｎｔ）,其编码产物由６９６个氨基酸（ａａ）组成,推测其分子量为７７．７ｋＤ。编码蛋白氨基酸同源性分析表明,ＥＤＳＶ１００Ｋ蛋白与人腺病毒（Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１２、Ａｄ４１）、Ⅰ群禽腺病毒（ＣＥＬＯ和ＦＡＶ１０）的同源性为３２．３～３４．４％之间,而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性达到５６．４％。     

用Vero细胞大量制备传染性法氏囊病病毒

目前传染性法氏囊病病毒疫苗主要是用原代鸡胚成纤维细胞 (ＰＣＥＦ)增殖ＩＢＤＶ进行生产。由于ＳＰＦ种蛋价格高 ,且ＳＰＦ种蛋在取得及培养过程中易被外源病原污染 ,造成产品质量的不稳定 ,生产成本很高[1] 。Ｖｅｒｏ细胞系是一种贴壁依赖性的传代细胞系 ,ＷＨＯ已经批准用Ｖｅｒｏ细胞作为载体进行病毒疫苗的生产。目前已成功地应用Ｖｅｒｏ细胞生产出脊髓灰质炎病毒疫苗和狂犬病毒疫苗[2 ] 。用Ｖｅｒｏ细胞生产传染性法氏囊病病毒疫苗也会有较好的前景。我们已完成了在Ｖｅｒｏ细胞上静止状态下增殖ＩＢＤＶ弱毒株的培养条件研究 ,而…