HGF／SF-Met信号转导在前列腺腺癌中的作用：Pr-14c细胞转移表型获得的其他机制

背景HCF／SF能够通过与原癌基因受体Met结合，便于转移侵袭过程中上皮肿瘤和其周围机制的相互作用。本研究利用C3（1）Tag转基因鼠前列腺癌细胞模型，试图阐明HGF和Met在前列腺癌转移潜能中的相互作用。方珐外源HGF分别作用于前列腺腺癌细胞系（Pr-14）和前列腺癌转移细胞系（Pr-14c），用增殖分裂实验评价它们的有丝分裂情况，用扩散实验、侵袭小室实验来观察它们在细胞外基质底物上的形态学特性，用酶谱实验分析它们分泌的酶类。     

肝细胞生长因子-Met通路在胆囊癌进展中的作用

目的 通过检测Met蛋白在胆囊癌组织中的表达和肝细胞生长因子（HGF）对胆囊癌细胞系生长、运动侵袭能力的影响来探讨SF／HGF—Met通路在胆囊癌进展中的作用。方法 免疫组织化学（En Vision二步法）检测Met在胆囊癌组织中表达，以慢性胆囊炎、胆囊腺瘤和肝移植供体胆囊标本为对照。采用噻唑蓝（MIT）比色法以及体外运动、侵袭实验观察不同浓度梯度的HGF和格尔德霉素（GA）对胆囊癌细胞生长和运动侵袭能力的影响。结果Met在胆囊癌组织中表达＋7．14％（3／42），＋＋52．38％（22／42），＋＋＋40．48％（17／42），正常胆囊上皮和良性疾病胆囊上皮中正常胆囊和良性疾病-9．52％（2／21），＋66．67％（14／21），＋＋19．05％（4／21），＋＋＋4．76（1／21），在肿瘤组织中表达较强（P〈0．01）。本次实验所设定的浓度HGF对胆囊癌细胞系的生长促进作用不明显。运动侵袭试验中HGF对GBC—SD细胞迁移运动侵袭能力有诱导作用，并呈剂量依赖效应。GA本身对胆囊癌细胞运动侵袭能力抑制作用不明显，但是可以抑制HGF对胆囊癌细胞运动侵袭能力的诱导作用，差异有统计意义。结论 本研究提示了Met过度表达与胆囊癌发展的相关性，HGF—Met通路的激活在胆囊癌进展过程中起了一定作用。GA类药物有望成为抑制胆囊癌转移的有效药物。     

NK4基因转染对前列腺癌DU145细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

研究HGF拮抗剂NK4在前列腺癌中的作用。将包含NK4cDNA的表达载体pBudCE4．1-EGFP-NK4转染到DU145细胞中。体外实验检测白分泌的NK4对肿瘤细胞增殖、迁移、转移及凋亡的影响。体内实验裸鼠分为三组,分别皮下种植DUl45、空质粒转染的Dul45和NK4转染的DUl45细胞,检测皮下肿瘤的大小、细胞凋亡及细胞增殖情况。体外实验结果显示转染NK4的DUl45细胞可以分泌NK4蛋白。自分泌的NK4抑制HGF诱导的肿瘤细胞增殖、迁移及转移,促进凋亡（P〈0．01）。NK4可以调节HGF受体c－Met及其下游ERKl与Akt1／2蛋白的活性。体内实验显示,NK4转染DUl45细胞组的肿瘤生长及细胞增殖受到抑制,同时肿瘤细胞凋亡增加。本实验显示包含NK4cDNA的表达载体转染前列腺癌细胞可以有效地调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡。NK4作用于HGF／c－Met可以作为前列腺癌治疗的一个有效靶点。     

成纤维细胞通过肝细胞生长因子增强膀胱癌细胞的侵袭能力

目的间质细胞在肿瘤细胞的转化与侵袭过程中发挥了重要作用，本研究旨在阐明成纤维细胞源性因子，尤其是肝细胞生长因子（HGF），对膀胱癌细胞侵袭潜能的影响。方法体外细胞侵袭实验评价成纤维细胞TIG-1和HGF对多种膀胱癌细胞（5637、T24、J82、HT1376和MGHU-1）侵袭潜能的影响。RT—PCR检测上述细胞HGF和其受体c—Met的表达水平。酶联免疫吸附实验检测无转移的膀胱癌患者和正常人的血清HGF浓度，以阐明血清HGF水平和膀胱癌侵袭力之间的关系。结果体外细胞侵袭实验发现：在成纤维细胞TIG-1培养上清作用下，各种膀胱癌细胞体外侵袭力显著增强，但HOF的中和抗体可部分抑制这种效应。     

RhoC-siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响

目的构建RhoC-siRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法以脂质体转染法稳定转染人SK-Hepl肝癌细胞株，Western印迹鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况，观察转染前后细胞黏附、运动及体外侵袭能力的改变。结果酶切及测序证实RhoC—siRNA真核表达载体构建成功。通过Western印迹检测证实，转染RhoC—siRNA表达载体的肝癌细胞中RhoC蛋白表达抑制达60％，其黏附、移动及体外侵袭能力均降低。结论RhoC—siRNA表达载体能有效抑制RhoC在肝癌细胞株SK—Hepl中的表达，同时抑制细胞的侵袭转移潜能，为肝癌的生物学治疗提供新的方法。     

正常和恶性前列腺上皮组织中的中间细胞均表达c—Met意昧着前列腺癌的侵袭

背景角蛋白分析可区分前列腺癌的管腔细胞（K18）、中间细胞（K5／18）和基底细胞（K5／14）。目前认为，中间细胞是前列腺癌发生恶性转化的元凶，是前列腺癌发生激素非依赖性转化的前体细胞。我们证实了正常和恶性前列腺上皮组织内的中间细胞均表达HGF受体c-Met。方法三重染色法分析c—Met受体、K5、K14、K18的定位。分别计算15位正在接受去势治疗的前列腺癌患者和14位未行新辅助治疗患者c—Met强阳性细胞的百分率。     

锤头状核酶降低小鼠胰岛细胞经CD95途径的凋亡

目的研究锤头状核酶通过调控CD95的表达,对小鼠胰岛细胞凋亡的影响;探索提高胰岛移植物存活率的新途径。方法体外构建针对CD95mRNA93位点的锤头状核酶(pU6-Rz93)和突变型核酶(pU6-dRz93)。采用Ⅴ型胶原酶消化法分离小鼠胰岛细胞,通过干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素1α(IL-1α)诱导其高表达CD95后,经钠米载体-Effectene将核酶转染至该细胞。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测(Westernblot)法检测胰岛细胞CD95的表达。胰岛细胞经抗CD95的抗体(JO2)作用后,以Caspase-3活性检测试剂盒检测转染前后细胞Caspase-3活性的变化;MTT法测细胞的增殖;Annexin-Ⅴ凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,并观察了各组细胞对细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤的反应能力。结果细胞因子可诱导小鼠胰岛细胞高表达CD95分子。转染pU6-Rz93组的胰岛细胞CD95的表达与转染空载体组和转染pU6-dRz93组相比,明显下降。经JO2处理后,转染pU6-Rz93组胰岛细胞的Caspase-3活性和凋亡率明显降低,细胞增殖活性和抵抗CTL杀伤的能力显著增强。结论针对FasmRNA93位点的锤头状核酶能显著抑制小鼠胰岛细胞CD95的表达,使其免于CD95途径的凋亡;为提高胰岛移植物的存活率提供了实验基础。     

FAK的阻断对MHCC97肝癌细胞侵袭性的影响

目的 通过对MHCC97肝癌细胞株的FAK基因的表达进行干预，观察MHCC97肝癌细胞侵袭转移能力的变化。方法 用Oligofec TAMINE介导的方法，将反义FAK ODN引入MHCC97肝癌细胞株，或用Genistein抑制MHCC97肝癌细胞FAK磷酸化方法，观察经过不同干预后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的活力变化，比较MHCC97肝癌细胞转染反义FAK ODN前后和用Genistein抑制磷酸化前后，细胞侵袭转移能力的变化。结果 反义FAK ODN转染的肝癌细胞和用Genistein干预的肝癌细胞穿过Matrigel胶的能力减弱。结论抑制FAK的表达能影响肝癌细胞的侵袭转移能力。     

核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性抑制作用的研究

目的探讨锤头状核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据拟要切割的胆囊癌端粒酶RNA亚基模板两翼区的序列，体外合成锤头状核酶的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体。酶切及测序鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞，观察其对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对细胞生长、增殖的作用，并设空载体转染组和单纯脂质体转染组作为对照。结果与对照组比较，实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性明显减低；核酶基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低；细胞的分裂、增殖受到明显抑制。核酶作用后10d凋亡率为17、10％，13d后凋亡率为31．01％。结论核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用，并能抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞凋亡。     

Gli-1基因的RNAi对前列腺癌DU145细胞的影响

目的研究胶质瘤相关癌基因1(Gli-1)对前列腺癌DU145细胞的生物学影响。方法通过脂质体介导的方法将Gli-1 SiRNA转染前列腺癌DU145细胞,RT-PCR检测Gli-1 mRNA变化,Western Blot法检测其蛋白的表达,CCK-8法检测转染后细胞增殖,运用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果转染Gli-1SiRNA的细胞Gli-1的表达明显低于阴性对照组(NC)与空白组(P﹤0.05),Gli-1SiRNA抑制细胞增殖并降低细胞的侵袭能力。结论 Gli-1 SiRNA可抑制前列腺癌DU145细胞中Gli-1的表达,降低细胞增殖率和侵袭能力,提示Gli-1可能在前列腺癌的恶性进展中起着重要作用。     

抗Fas核酶抑制Fas介导的小鼠肝脏细胞凋亡的研究

目的 研究抗Fas锤头状核酶对原代培养的小鼠肝脏细胞Fas表达及其凋亡的影响。方法 采用胶原酶灌流法分离小鼠肝脏细胞，同时构建了针对Fas mRNA的锤头状核酶真核质粒，经纳米载体Effectene将其导入肝细胞，通过RT-PCR、Western blot检测细胞Fas的表达，以Caspase-3活性检测试剂盒测转染前后细胞Caspase-3活性的变化，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒测转染前后细胞凋亡，MTT法测细胞的增殖。结果 小鼠原代肝细胞上表达Fas，抗Fas核酶能显著降低肝细胞上Fas水平，经抗Fas抗体作用后，转染核酶的细胞Caspase-3活性明显降低，该细胞增殖活性较对照组增强，而凋亡率明显降低。结论 抗Fas核酶能显著降低小鼠原代肝细胞上Fas的表达，使其免于Fas途径的凋亡。     

锤头状核酶调控CD95介导小鼠皮肤成纤维细胞凋亡

目的　观察抗CD95的锤头状核酶对新生小鼠皮肤成纤维细胞 CD95 表达及其凋亡的影响。方法　采用胶原酶消化法分离新生小鼠皮肤成纤维细胞,并构建了针对 CD95 mRNA的锤头状核酶,经钠米载体 Effectene将其转染至成纤维细胞。通过 RT PCR、流式细胞仪检测成纤维细胞上CD95表达;细胞经抗CD95 抗体(JO2)作用后,通过 Caspase 3 活性检测试剂盒测转染前后细胞Caspase 3活性的变化;MTT法测细胞的增殖;Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒测细胞凋亡。结果　新生小鼠皮肤成纤维细胞上表达CD95,抗CD95核酶能显著降低细胞表面CD95水平;细胞与抗 CD95 抗体孵育后,与空白对照和空载体转染组相比,核酶转染组细胞 Caspase 3 活性和凋亡率明显降低,转染核酶的细胞增殖活性显著增强。结论　抗 CD95 核酶能显著降低新生小鼠皮肤成纤维细胞上CD95表达,使其免于CD95途径的凋亡,为提高皮肤移植物存活提供了实验依据。     

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1反义寡核苷酸转染对胃癌细胞形态及侵袭移行能力的影响

目的观察T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam 1）反义寡核苷酸（ASODN）转染对胃癌细胞形态及体外侵袭、移行能力的影响。方法采用层黏连蛋白黏附法，由胃癌MKN-45细胞株（M0）中筛选获得高侵袭转移亚株（MH）。以脂质体介导将Tiam 1 ASODN转染至MH细胞中，并应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及流式细胞技术分别检测Tiam 1 mRNA和蛋白的表达。采用苏木精-伊红染色、细胞骨架蛋白染色、扫描电镜技术及Boyden小室法分别观察转染与未转染MH细胞在形态学及体外侵袭、移行能力方面的变化。结果与对照组相比，应用0．43μmol／L Tiam 1 ASODN转染可特异性抑制胃癌MH细胞中Tiam 1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）。Tiam 1 ASODN转染MH细胞较未转染MH细胞的体外侵袭、移行能力显著下降（P〈0．05或P〈0．01），同时转染MH细胞较未转染MH细胞膜表面突起及伪足变稀疏或缩短、细胞骨架结构紊乱程度降低、斑点状肌动蛋白小体减少。结论特异性ASODN转染可有效抑制Tiam 1在胃癌细胞中的表达并削弱其体外侵袭、移行能力，这可能是通过调整胃癌细胞骨架结构重组、降低其变形、游走能力而实现的。     

miR-214对胃癌细胞SGC7901侵袭和转移能力的影响

目的:探讨miR-214对胃癌细胞侵袭和转移能力的影响及其可能作用机制。方法:应用miRanda,TarBase v.5c靶基因预测网站分析miR-214与PTEN mRNA的可能结合位点,分别将miR-214模拟物(mimics),拮抗物(inhibitors)和无关序列转染到SGC7901细胞株,以空白转染组为阴性对照,用Western blot的方法比较各组细胞PTEN蛋白的表达,用Transwell侵袭小室检测各组细胞侵袭能力的变化。结果:Western blot结果显示,miR-214 mimics转染组的SGC7901细胞中PTEN蛋白表达较其余各组显著降低(均P<0.05),Transwell侵袭小室检测结果表明,miR-214 mimics转染组的细胞侵袭细胞数明显多于其余各组(均P<0.05)。结论:miR-214能促进胃癌细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制PTEN的表达有关。摘要     

锤头型核酶特异性阻断雄激素受体表达对前列腺癌细胞生长的影响

目的：探讨核酶阻断雄激素受体（AR）基因表达治疗前列腺癌的可能性。方法：在脂质体介导下，锤头型抗雄激素受体核酶表达载体转染前列腺癌细胞，采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测ARmRNA，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期时相，原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡。结果：核酶表达载体转染1－5d后，前列腺癌细胞AR mRNA水平降低32．6％－40．7％（P＜0．05），细胞生长抑制率18．28％－35．34％（P＜0．05），细胞周期阻滞于G2／M期，诱导细胞凋亡，细胞凋亡比率增加20．70％（P＜0．01）。结论：应用核酶特异性切割ARmRNA，能有效阻断AR基因的表达，诱导前列腺癌细胞凋亡，有可能成为前列腺癌基因治疗的有效方法之一。     

Hepsin基因对前列腺癌PC3细胞侵袭和增殖能力的影响

目的:研究Hepsin基因对前列腺癌PC3细胞生物学特性的影响。方法:用脂质体介导的基因转染技术,将pHepsin-IRES2质粒转染前列腺癌PC3细胞,用G418(600mg/L)筛选出阳性克隆。实时PCR检测转染前后Hepsin表达;MTT法和BrdU法检测细胞生长曲线;Boyden小室和划痕法观察转染前后细胞侵袭力的变化。结果:建立稳定表达Hepsin基因的PC3细胞系;转染Hepsin基因的PC3细胞的生长速度和转染空载体的对照组没有显著差异;转染Hepsin基因后前列腺癌PC3细胞的侵袭力显著增加(P<0.05)。结论:Hepsin基因对前列腺癌PC3细胞的增殖无显著作用,可明显促进PC3细胞的侵袭力。     

MicroRNA-212在前列腺癌中的表达和功能研究

目的检测microRNA-212在前列腺癌组织和细胞株中的表达情况并研究其与前列腺癌细胞增殖、侵袭及凋亡的关系。方法检测前列腺癌标本及细胞系中microRNA-212的表达情况。在DU145和PC3转染microRNA-212 mimics、microRNA-212 inhibitor或者NC阴性对照物,通过MTT、Transwell、流式细胞仪检测其相关生物学情况。结果前列腺癌组织中的microRNA-212表达显著低于癌旁组织。前列腺癌细胞系中microRNA-212较正常前列腺上皮细胞系的表达低。microRNA-212的表达与Gleason评分、脉管侵犯和淋巴结转移密切相关。MTT实验和Transwell实验表明,转染了microRNA-212 mimics的DU145和PC3细胞,其增殖率降低,microRNA-212的上调抑制了DU145和PC3细胞的迁移和侵袭能力。转染了microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3细胞则表现出较强的增殖、迁移和侵袭能力。流式细胞仪分析结果表明,转染了microRNA-212 mimics的DU145和PC3细胞的凋亡显著增加,转染了microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3细胞凋亡受到抑制。结论前列腺癌组织中microRNA-212表达显著下降,microRNA-212的表达与Gleason评分、脉管侵犯和淋巴结转移密切相关,microRNA-212能够抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭并促进前列腺癌细胞凋亡。     

锤头状核酶阻断雄激素受体基因表达的研究

目的　探讨核酶 (RZ)在细胞水平调节雄激素受体 (AR)基因表达的作用。方法　设计并合成针对AR的锤头状核酶序列 ,分子克隆技术构建活性核酶和无活性核酶表达载体 ,脂质体介导下转染雄激素受体表达阳性细胞株T47D。转染第 1～ 3天 ,应用免疫组织化学和逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测细胞内AR基因表达水平。结果　AR活性核酶表达载体转染后 ,T47D细胞ARmRNA水平降低 2 2 .4%～ 50 .7% (P <0 .0 5) ,AR蛋白阳性细胞减少 7.1 0 %～1 1 .90 % (P <0 .0 5)。而无活性核酶对细胞AR基因表达差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　成功构建AR锤头状核酶表达载体 ,能特异性切割ARmRNA ,阻断雄激素受体基因表达     

HGF/c-Met及MVD在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义

目的 :探讨膀胱移行细胞癌 (BTCC)中肝细胞生长因子 (HGF)及其受体 (c Met)、FⅧ因子 (MVD)表达的临床意义。方法 :采用免疫组化SABC法对 4 9例BTCC及 10例正常膀胱黏膜组织中HGF、c Met及MVD的表达进行观察。结果 :①随肿瘤的分期、分级的增加 ,c Met、MVD表达显著增加 (均P <0 .0 1) ;②HGF在BTCC不同分期、分级之间表达差异无显著性意义 (均P >0 .0 5 ) ;③HGF、c Met高表达同MVD表达增强显著相关 (均P <0 .0 5 ) ;④c Met、MVD高表达是患者预后不良的危险因素 (均P <0 .0 5 )。结论 :HGF/c Met在BTCC侵袭进展过程中起重要作用 ,可能是估计BTCC预后的一个有用指标     

肝细胞生长因子下游分子ezrin对肝癌恶性生物学行为的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)下游分子ezrin对肝癌细胞生长和转移的影响,为肝癌转移治疗提供新的思路和理论基础。方法选取同一亲本来源的低转移细胞系SMMC7721和高转移细胞系SF7721为研究对象,首先运用免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot比较ezrin和actin的表达差异。进一步应用RNA干扰下调SF7721中ezrin表达,观察其运动和侵袭能力的改变。结果SF7721的ezrin和F-actin表达明显高于SMMC7721,增高的actin为γ-actin。下调ezrin后,SF7721的生长(分裂期：28．07％下降到23．53％)和侵袭能力[穿膜细胞数：(47,75±4．46)个／视野下降到(31．75±2．81)个／视野]均显著下降(P＜0．05),与SMMC7721的生长和转移差异无统计学意义(P＞0．05)。结论ezrin与HGF介导的肝癌生长侵袭相关,有可能成为抑制肝癌复发转移的新靶点。