过表达CodY蛋白的苏云金芽胞杆菌基因工程菌YBT-881-L1的构建及特性鉴定

为研究革兰氏阳性菌中的全局性转录调控因子CodY在苏云金芽胞杆菌中的作用机制,利用苏云金芽胞杆菌野生株YBT-881,构建了过表达CodY蛋白的基因工程菌YBT-88 1-L1,并对此工程菌的特性进行了研究.结果表明,YBT-881-L1和野生株的生长曲线以及伴胞晶体形态无明显差异.SDS-PAGE及质谱分析发现,野生株中沉默的cy2Ac4基因在工程菌中被激活,并产生大量的Cry2Ac4蛋白.生物测定结果表明,重组菌株YBT-881 -Ll较野生株对鳞翅目害虫棉铃虫的杀虫活性明显增强.     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

苏云金芽胞杆菌3-羟基丁酮代谢基因簇的转录调控

摘要:【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)3-羟基丁酮代谢基因簇aco的转录调控和acoR突变体的表型特征,明确aco基因簇的转录调控机制和对芽胞产量及Cry蛋白产量的影响。【方法】通过生物信息学方法分析aco基因簇的结构,RT-PCR分析基因簇的转录单元,采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株的acoR 基因,利用启动子融合lacZ的方法分析启动子的转录活性。利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量。【结果】aco基因簇由acoABCL 4个基因组成,形成一个转录单元。aco基因簇的启动子PacoA转录活性在sigL(编码Sigma 54因子)和acoR突变体中均明显降低。acoR基因的缺失对菌体生长和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使菌体运动能力减弱,使芽胞产量略有下降,并且不能利用3-羟基丁酮。【结论】aco操纵子受Sigma 54控制,并由AcoR激活,aocR基因的缺失影响菌体对3-羟基丁酮的利用,但对Cry蛋白产量无显著影响。     

苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响

【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。     

苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控和bkdR突变体的表型特征,明确bkdR所在基因簇的转录调控机制和对Cry蛋白产量的影响。【方法】通过生物信息学方法分析bkdR所在基因簇的结构,RT-PCR分析基因簇的转录单元,采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株的bkdR基因,利用启动子融合lacZ的方法分析启动子的转录活性。利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量。【结果】bkd基因簇由8个基因组成,其中ptb-bkdB7个基因组成1个转录单元。ptb基因的启动子转录活性在sigL和bkdR突变体中均明显降低。bkdR基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无影响,但使运动能力减弱。【结论】bkd操纵子受Sigma 54控制,并由BkdR激活,bkdR基因的缺失对Cry蛋白产量无影响,对菌株的运动能力有影响。     

苏云金芽胞杆菌BkdR和CcpA对bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)转录调控因子BkdR和多效调控因子CcpA对亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸代谢基因簇bkd的转录调控,明确bkd基因簇的转录调控机制。【方法】通过β-半乳糖苷酶活性测定分析bkd基因簇启动子的诱导转录活性,采用同源重组技术敲除Bt HD73菌株的ccpA基因,通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化BkdR和CcpA蛋白,通过凝胶阻滞实验明确BkdR和CcpA蛋白与bkd基因簇启动子的结合作用。【结果】亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸可诱导bkd基因簇启动子Pptb的转录活性。Pptb的诱导活性在bkdR突变体中明显降低,而在ccpA突变体中明显上升。BkdR和CcpA蛋白与Pptb均有结合作用。【结论】bkd基因簇的转录活性受BkdR正调控,而受CcpA负调控。     

蜡状芽胞杆菌转录激活子PIcR调控多基因的表达

蜡状芽胞杆菌是一种条件致病菌 ,它能引起食物中毒和其它形式的疾病。潜在的致病因子包括磷脂酶C、溶血素、肠毒素和呕吐毒素等。在很多致病菌中致病因子的表达都是协同调控的。从蜡状芽胞杆菌模式菌株ATCC1 4579经转座子诱变的文库 ,筛选到一株磷脂酶阴性的突变子 ,该突变子的蛋白酶活性明显减弱了。插入位点的序列分析表明 ,一个高度同源于苏云金芽胞杆菌转录激活子PlcR的基因被插入失活了。研究结果表明 ,除在苏云金芽胞杆菌中能激活磷脂酰肌醇磷脂酶C基因的转录外 ,转录激活子PlcR至少还能调控卵磷脂酶和一个或多个蛋白酶基因的表达 ,这是一个多效调节因子。     

蜡状芽胞杆菌转录激活子PlcR调控多基因的表达

蜡状芽胞杆菌是一种条件致病菌,它能引起食物中毒和其它形式的疾病。潜在的致病因子包括磷脂酶C、溶血、肠毒素和呕吐毒素等。在很多致病菌中致病因子的表达都是协同调控的。从蜡状芽胞杆菌模式菌株ATCC14579经转座子诱变的文库,筛选一株磷脂酶阳性的突变子,该突变子的蛋白酶活性明显减弱了。插入位点的序列分析表明,一个高度同源于苏云金芽胞杆菌转录激活PlcR的基因被插入失活了。研究结果表明,除在苏云金芽胞杆菌中能激活磷脂酰肌醇磷脂酶C基因的转录外,转录激活子PlcR至少还能调控卵磷脂酶和一个或多个蛋白酶基因的表达,这是一个多效调节因子。     

苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigL基因突变体的特性分析

[目的]通过分析苏云金芽胞杆菌sigL基因突变体的特征,进一步明确sigL基因在苏云金芽胞杆菌中的功能.[方法]测定了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株,sigL基因缺失突变菌株和互补菌株在不同营养成分的培养基中的生长曲线以及在不同氮源条件下的生长情况.分别将调控aco操纵子(编码3-羟基丁酮脱氢酶系统)的转录调节基因acoR和调控bkd操纵子(编码催化支链脂肪酸合成的酶系统)的转录调节基因bkdR的启动子与lacZ基因融合,并转入出发菌株和sigL突变体中,测定β-半乳糖苷酶的活性.[结果]sigL突变体不能利用精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸为唯一的氮源;β-半乳糖苷酶的活性分析表明:在sigL突变体中acoR基因和bkdR基因的启动子活性降低.序列比对分析表明:Bt中的AcoR和BkdR的蛋白结构域与依赖于σL的转录调节因子的保守序列相似.[结论]苏云金芽胞杆菌中sigL基因的缺失可能阻碍了某些重要碳、氮源参与的代谢途径.在Bt中AcoR和BkdR是依赖于σL的转录调节因子.     

苏云金芽胞杆菌sigK 基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影响

摘要: 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt) sigK 基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A 基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK 基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE 等方法分析了突变体的特点; 构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证; 利用启动子融合lacZ 技术检测了cry3A 基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢; 扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力; SDS-PAGE 分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315 携带sigK 基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力; sigK 基因的突变可以提高cry3A 基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A 启动子指导的Cry 蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK 基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量; sigK 基因功能的丧失有利于cry3A 基因启动子在产胞后期的转录。     

碱性条件下苏云金芽胞杆菌基础代谢分析

【目的】探索苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)形成转录差异的碱性条件,明确B.thuringiensis在该条件下的基础代谢途径变化。【方法】采用半定量RT-PCR技术及实时荧光定量PCR技术,确定碱刺激下参考基因psp A存在表达差异的碱性处理条件。在该条件下提取RNA进行Agilent定制B.thuringiensis表达谱芯片杂交,对芯片数据进行差异表达分析、GO富集分析及生物途径富集分析等。【结果】通过检测psp A表达变化,将对数生长中期的菌体加入终浓度为28 mmol/L的Na OH并诱导培养10min,作为B.thuringiensis响应碱刺激的研究条件。富集分析表明碳代谢、脂肪酸合成代谢、氨基酸合成代谢途径变化明显。细胞糖酵解途径至少19个酶促基因上调表达,三羧酸循环中催化α-酮戊二酸转化为苹果酸的大部分酶蛋白编码基因上调2倍以上。【结论】本研究发现在碱性条件下B.thuringiensis基础代谢明显增强,细胞可能通过大量合成酸性物质如乳酸、苹果酸等来提高细胞对于碱性环境的适应能力。     

Limosilactobacillus fermentum F-6的遗传背景和功能基因组

【目的】Limosilactobacillus fermentum具有增强免疫力、产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)等多种功能特性,广泛应用于食品领域,具有较高经济价值。本文从群体遗传学角度,解析L. fermentum F-6的遗传背景和功能基因特征,为其开发利用提供遗传学基础。【方法】本研究对NCBI已公开的23株L. fermentum全基因组序列和1株模式菌株ATCC 14931T的基因组序列进行比较基因组学分析。利用Roary软件识别核心基因集与泛基因集;采用rapid annotation using subsystem technology(RAST)网站对基因组进行功能注释,以探究F-6基因组特征。【结果】以识别到的997个核心基因构建系统发育树,发现聚类趋势与分离源无关,但F-6与3株食品分离株聚在同一分支。功能注释分析发现,24株L. fermentum中仅F-6含有参与支链氨基酸合成途径的基因(ilvD、leuA等),可为机体提供必需氨基酸。F-6含有大量编码糖基转移酶和UDP-葡萄糖4-表异构酶的基因,且含有1个完整的eps基因簇。与其他L...     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

肺囊康定产生菌Glarea lozoyensis线粒体基因组序列的再分析

[目的] Glarea lozoyensis是抗真菌药物卡泊芬净的产生菌,其突变菌株ATCC 74030的线粒体基因组已被报道。我们此前的研究发现诱变剂能引起该菌某些细胞核基因的突变,但诱变剂是否也能引起线粒体DNA序列的改变并不清楚。[方法] 组装野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,并与发表的突变型菌株ATCC 74030的线粒体基因组进行比较。通过PCR验证野生和突变菌株线粒体基因组间表现差异之处,并利用正确的线粒体基因组序列进行新的分析。[结果] 我们成功组装出野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,通过比较其与发表的ATCC 74030的线粒体基因组序列,发现存在6处单核苷酸变异位点和2处具有长度差异的区域。然而,随后的PCR验证和序列比较并没有发现2个菌株间存在这些差异。最初观察到的碱基差异是因为发表的ATCC 74030线粒体基因组存在序列错误。有趣的是,在Glarea lozoyensis的线粒体基因组中,我们发现存在3个具有内含子的tRNA基因和1个rnpB基因。同时,该菌线粒体基因组中存在多种重复序列,在其线粒体和细胞核基因组间也存在明显的DNA片段重复事件。[结论] 诱变剂没有引起G. lozoyensis线粒体DNA的任何改变;发表的ATCC 74030的线粒体基因组存在序列错误。我们报道G. lozoyensis正确的线粒体基因组序列,并且发现该菌线粒体和细胞核基因组间频繁的基因交流。     

母乳源乳双歧杆菌Probio-M8的遗传特征及基因组差异比较分析

【目的】母乳源乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） Probio-M8具有优良的益生特性,本文拟从全基因组水平解析Probio-M8的遗传特征,并与已有益生功效的乳双歧杆菌的基因组进行比较分析。【方法】本研究基于NCBI已公开的21株乳双歧杆菌和1株模式菌株DSM10140^T的基因组数据,构建了核心基因集与泛基因集,解析该群体的系统发育关系,比较分析Probio-M8的遗传特征及功能基因组。【结果】22株乳双歧杆菌的泛基因集包含1 618个基因,其中核心基因1 514个,占泛基因集的93.57%,表明乳双歧杆菌核心基因集高度保守。以1 514个核心基因构建系统发育树,发现22株乳双歧杆菌分为两个分支,AD011单独为一个分支,Probio-M8和其他菌株与模式菌株DSM10140^T聚在同一分支,且Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07、HN019的遗传距离极为接近。进一步分析耐药基因和毒力基因,在Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07、HN019基因组上均检测到DfrA...     

乌鳢源杀鱼爱德华菌的分离鉴定及药敏特性研究

[背景] 江苏省扬州市某乌鳢养殖场发生疾病,给养殖户造成了严重的经济损失。[目的] 确定病因并筛选出敏感药物,为乌鳢相关疾病的防治提供参考。[方法] 从患病乌鳢体内分离致病菌,并从形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测等方面对分离菌株进行鉴定,同时开展人工感染试验分析其致病性,通过纸片扩散法进行药敏特性分析。[结果] 从患病乌鳢体内分离获得优势菌株SHL,经形态特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测鉴定为杀鱼爱德华菌。进一步人工感染试验证实其对乌鳢有较强的致病性,LD₅₀为1.6×10⁵ CFU/g,发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。[结论] 引起江苏省扬州市某养殖场的乌鳢体表溃烂及死亡的病原菌为杀鱼爱德华菌,这是我国首次从淡水鱼类中检出致病性杀鱼爱德华菌,表明该菌的感染谱在扩大,需引起水产养殖领域的重视,在养殖过程中可根据药敏实验结果选用合适的国标渔药进行防治。     

酱香型白酒发酵中地衣芽孢杆菌前噬菌体的鉴别

【背景】噬菌体是微生物群落的重要组成部分,但传统白酒发酵中噬菌体的分类和存在尚不清楚。【目的】通过检测公共数据库和酱香型白酒发酵中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组中的前噬菌体整合区域,探究传统酱香型白酒发酵中关键功能菌株的前噬菌体分类和侵染情况。【方法】使用未培养(细菌全基因组分析)和可培养(菌株筛选和特异性PCR反应)技术对不同环境来源和来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体的分类和存在进行解析。【结果】细菌全基因组分析显示,30株来自不同环境的地衣芽孢杆菌基因组中共注释到165个前噬菌体,其中63.6%(105/165)为完整前噬菌体序列。97.1%感染地衣芽孢杆菌的噬菌体属于长尾噬菌体科(Siphoviridae),2.9%属于肌尾噬菌体科(Myoviridae),53.0%完整前噬菌体的基因功能未知。在来自酱香型白酒发酵的B. licheniformis MT-B06中检测到7个前噬菌体整合序列,其中57.1%(4/7)为完整前噬菌体序列,来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌存在多种不同前噬菌体的共感染。来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体存在来自细菌基因组上相邻CotD孢子外壳蛋白(CotD family spore coat protein)基因的水平基因转移。在26株来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌中,69.2%(18/26)存在噬菌体编码主要衣壳蛋白的基因,100.0%(26/26)存在噬菌体编码CotD孢子外壳蛋白的基因。【结论】来自不同环境的地衣芽孢杆菌和酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌中存在高水平的前噬菌体整合,来自酱香型白酒发酵的地衣芽孢杆菌前噬菌体中广泛存在来源于宿主的CotD孢子外壳蛋白基因的水平基因转移。本研究为首次对传统发酵白酒中噬菌体的分类和存在进行探究,有助于对发酵微生物群落中噬菌体-细菌相互作用加深理解。     

微小杆菌属(Exiguobacterium)细菌的能量代谢途径分析

【目的】微小杆菌属(Exiguobacterium)细菌广泛分布于海洋及非海洋环境中,具有多种代谢途径以适应复杂多样的生境。本研究从能量代谢途径角度出发,探究该属菌株对不同生境的适应能力。【方法】从美国国家生物科技数据中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中获取146个Exiguobacterium属菌株的基因组,查找并统计光营养、厌氧呼吸和底物代谢等多种能量代谢途径的关键蛋白或关键酶基因在各菌株基因组中的分布,包括光营养型的视紫红质基因、厌氧呼吸营养型的钼辅因子合成蛋白基因,以及底物代谢营养型中乙醛酸分流途径的异柠檬酸裂解酶及苹果酸合酶基因等。根据对应的氨基酸序列构建视紫红质、MoaC和异柠檬酸裂解酶的系统发育树,分析不同能量代谢途径在该属菌株进化过程中的保守性,推测其对于该属菌株的重要性。【结果】Exiguobacterium属中50%的种具有视紫红质基因,其中分离自非海洋生境的菌株更趋向于含有视紫红质基因。本研究所统计的全部非海洋生境菌株中,含有视紫红质基因的菌株占比约为70%,而在海洋生境菌株中该比例...