含IL-15基因佐剂的肿瘤疫苗对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞功能

目的：研究含有小鼠IL-15基因佐剂的肿瘤疫苗对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的功能影响。方法：构建含有小鼠IL-15基因佐剂的肿瘤疫苗，免疫小鼠后，分离脾脏淋巴细胞，分析CTL的表面分子，分泌细胞因子能力，细胞毒功能和抗凋亡能力。结果：含有小鼠IL-15基因佐剂的肿瘤疫苗能上调CTL的CD8和CD44分子表达，促进IFN-1分泌，增强细胞毒功能，提高抗凋亡能力。结论：IL-15能发挥很好的佐剂效应，增强CTL的功能，有望在抗肿瘤研究中得到很好的应用。     

过继回输腺病毒介导的白细胞介素10基因转染CTL对机体抗肿瘤免疫功能的增强效应

本研究探讨了白细胞介紊10(IL-10)对小鼠体内抗肿瘤免疫功能的影响。鉴于C26结肠癌细胞转染了IL-10基因后在体内的致瘤性明显下降，本研究构建了一株对C26结肠癌细胞具有杀伤括性的CD8^ CTL并观察了IL-10基因转染的该细胞株对肿瘤的治疗作用。携带IL-10基因的重组腺病毒能有效介导小鼠琳巴细胞的基因转染并使之分泌较高水平的IL-10。IL-10基因转染的CTL过继回输荷瘤小鼠体内能明显增强荷瘤小鼠的体内抗肿瘤免疫功能，使实验性肺转移小鼠肺部转移结节数明显减少．这表明，IL-10对于过继回输的肿瘤特异性CTL的免疫功能具有明显的增强作用。     

肿瘤基因疫苗—肿瘤免疫治疗的新途径

肿瘤细胞能表达肿瘤相关抗原（ＴＡＡ）。ＴＡＡ基因的克隆与鉴定为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。肿瘤基因疫苗以ＴＡＡ为攻击靶点,诱导机体产生ＴＡＡ特异性抗肿瘤免疫,能够刺激宿主产生ＴＡＡ特异性抗体和能溶解肿瘤细胞的细胞毒Ｔ淋巴细胞,并获得对相应肿瘤的免疫保护能力。接种肿瘤基因疫苗的小鼠能够排斥同种移植瘤的形成,延长荷瘤小鼠的生存期。     

基础理论

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定,淫羊霍苷体内抑瘤作用及其机制,基因佐剂的肿瘤疫苗对肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的影响,三联菌苗对小鼠肉瘤180的抑制作用,IL-12基因重组腺病毒对不同肿瘤抗瘤作用的研究,冻融人树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤免疫效应,     

IL-23基因修饰的树突细胞疫苗联合β-榄香烯对小鼠胰腺癌生长的影响

背景与目的:树突细胞(dendriticcells,DC)疫苗是目前最具应用潜能的治疗性疫苗,功能性细胞因子能显著增强DC的活性及其诱导的宿主抗肿瘤作用,利用细胞因子基因修饰DC是当今肿瘤免疫治疗中最活跃的领域。本研究探讨β-榄香烯联合白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)修饰的DC疫苗对胰腺癌小鼠的协同抗肿瘤作用。方法:克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗。将IL-23基因转染的DC疫苗、空质粒转染的DC疫苗、未转染的DC疫苗及对照生理盐水分别注射小鼠,体外观察各组小鼠脾脏T淋巴细胞IFN-γ及IL-4的分泌。体内观察β-榄香烯联合DC疫苗对荷胰腺癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及对小鼠存活期的影响。结果:基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强。接种IL-23转染DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强,有效地延缓并防御接种肿瘤的发生。DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,未转染DC疫苗组和空质粒转染DC疫苗组IL-4分泌量与IL-23转染的DC疫苗组比较差异有显著性(P<0.05);IL-23转染DC疫苗组IFN-γ的分泌与其他各组比较差异有显著性(P<0.01)。β-榄香烯联合IL-23转染DC疫苗组肿瘤生长受到显著抑制,该组小鼠存活期与DC组、NS对照组及β-榄香烯组比较差异有极显著性(P<0.01)。结论:IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的Th1及CTL的免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力。β-榄香烯有一定的协同抗癌作用。     

IL-18基因增强肿瘤抗原致敏DC诱导的CTL特异性杀伤肝癌细胞

目的: 探讨腺病毒介导的白细胞介素-18(IL-18)基因转染能否使肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dentritic cell,DC) 在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应.方法:携IL-18 的重组腺病毒载体感染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL-18-HepG2/DC), FACS分析AdIL-18-HepG2/DC表面分子的表达, ELISA法检测IL-18的分泌水平, 3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力, MTT法检测细胞毒性T 淋巴细胞杀伤效应.结果:AdIL-18-HepG2/DC较未转染DC能高水平地表达CD1a、CD11c、CD80、CD86以及HLA-DR;较未经IL-18转染的DC分泌较高水平的IL-18.AdIL-18-HepG2/DC 能非常有效地刺激自体T 细胞增殖(CPM 值为228 018±1 079),其刺激强度显著强于AdIL-18DC、HepG2/DC、AdlzcZ/DC及DC(均P＜0.05).当靶细胞为HepG2时,AdIL-18-HepG2/DC诱导的CTL杀伤活性显著高于其他各组(均P＜0.05),并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比.结论:IL-18 基因转染且肝癌抗原致敏的DC可以显著增强DC的特异性抗肝癌效应.     

IL-12协同B7-1转基因细胞增强C57BL/6小鼠的抗肿瘤免疫

目的:应用逆转录病毒构建IL-12、B7-1表达载体,以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用.方法:将两种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞,使该细胞能表达分泌B7-1或IL-12,并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果.结果当接种了EL-4/IL-12转染细胞后,在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P＜0.01),在EL-4/IL-12组的肿瘤被排斥后,实验动物体内诱发了抗EL-4/Wt的全身性、保护性免疫,用51Cr释放测定法证明有一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要与CD4+、CD8+和NK细胞有关.用EL-4/IL-12基因转染的瘤细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo瘤细胞作疫苗治疗能更加有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P＜0.005),EL-4/IL-12和EL-4/B7-1基因联合转染组比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P＜0.005).结论:研究结果提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的,IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中有一定的应用前景.     

重组白介素-12治疗小鼠Lewis肺癌的实验研究

背景与目的:白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,本研究建立稳定表达小鼠IL-12(murineinterleukin-12,mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效。方法:脂质体转染LLC获得LLC/mIL-12瘤苗。于C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞2×106个,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7天瘤内注射质粒或瘤苗,第14天处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞中CTL细胞和NK细胞活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。结果:LLC/mIL-12瘤苗组和pcDNA3.1( )-mIL-12质粒组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK细胞和CTL细胞活性,两者均以LLC/mIL-12治疗组更显著,LLC/mIL-12和pcDNA3.1( )-mIL-12治疗组有大量CD4 、CD8 淋巴细胞浸润。结论:mIL-12基因能增强NK细胞和CTL活性,LLC/mIL-12及pcDNA3.1( )-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。     

表皮生长因子受体通路底物8疫苗对乳腺癌细胞的抑制效应及其可能机制

目的：探索表皮生长因子受体通路底物8（epidermal growth factor receptor substrate 8,EPS8）疫苗对乳腺癌细胞的抑制效应及其可能的机制。方法:Western blotting检测EPS8蛋白在小鼠乳腺癌4T1细胞株中的表达。通过基因重组、表达和纯化等技术制备特异性的小鼠源性EPS8,以EPS8蛋白为靶点制备抗肿瘤疫苗并免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定免疫前后不同时间小鼠血清内抗EPS8抗体效价;流式细胞术检测免疫前后的脾T淋巴细胞亚群比例。建立乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠模型并接种EPS8疫苗,接种佐剂作为对照,比较2组荷瘤小鼠的生存期、肿瘤体积、肿瘤重量,计算EPS8疫苗抑瘤率;流式细胞术检测荷瘤小鼠脾T淋巴细胞亚群比例,LDH法检测其细胞毒性T细胞（CTL）杀伤率。结果：EPS8蛋白在乳腺癌4T1细胞株中高表达。成功构建的EPS8蛋白疫苗免疫小鼠后产生抗EPS8抗体,且随着免疫次数的增加,小鼠体内抗EPS8抗体滴度呈上升趋势。乳腺癌4T1细胞接种于经EPS8疫苗或佐剂免疫后的小鼠后,与佐剂对照组相比,EPS8疫苗组小鼠生存期显著升高\[中位生存时间：44(38~50) vs 37 (34~40) d; t=2.477, P=0043\],肿瘤质量显著降低\[（2.21±0.35）vs（331±0.88）g;t=3.574,P=0.009\],EPS8疫苗的抑瘤率为33.23%。EPS8疫苗组小鼠脾CD4+T比例和CD4+/CD8+比值均显著高于佐剂对照组（P<0.001）,EPS8疫苗组CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞的比值显著低于佐剂对照组（P<0.001）。效靶比为20〖DK〗∶1时,EPS8疫苗组CTL对靶细胞的杀伤活性即显著高于佐剂对照组\[(19.05±4.41)% vs (13.36±3.10)%;t=2263,P=0.040\] 。结论：EPS8疫苗不仅具有诱导小鼠产生体液免疫应答的功能,还能够降低荷瘤小鼠体内Treg细胞比例,激活机体内T细胞免疫功能;EPS8疫苗可抑制肿瘤的生长、有效延长荷瘤小鼠的生存期。     

调节性T细胞的分子靶向作用与肿瘤免疫治疗

调节性T细胞(Treg)具有免疫抑制功能,可通过在细胞表面表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、穿孔素-颗粒酶介导的细胞毒作用、分泌细胞因子如白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)等途径实现免疫抑制.采用抗体、疫苗和化学药物能够实现对FOXP3+CD25+CD4+调节性T细胞的靶向作用,使调节性T细胞在各种肿瘤患者外周血及肿瘤组织中的表达水平下调,降低其抑制免疫的功能,增强肿瘤免疫疗法的疗效.