携带小鼠白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞的作用

目的观察携带小鼠白细胞介素12(mIL12)基因的增殖型腺病毒载体对胃癌细胞的杀伤作用及mIL12表达情况。方法以携带目的基因的增殖型腺病毒CNHK200mIL12感染人胃癌细胞株SGC7901、人正常肝细胞株L02。首先,通过荧光显微镜下观察、细胞杀伤实验等观察病毒对细胞的杀伤能力;其次,通过Westernblot分析及双抗体夹心法(ELISA)检测mIL12表达情况。结果CNHK200mIL12感染SGC7901后,当MOI=10时即可杀伤大部分的肿瘤细胞,与ONYX015相当,而对正常细胞无明显杀伤。ELISA检测表明mIL12基因表达量达(267.2±34.6)ng/5×105个细胞/48h,较复制缺陷型腺病毒载体高近百倍。结论CNHK200mIL12能在胃癌细胞中复制及增殖杀死胃癌细胞,并高水平表达目的基因。     

增殖性腺病毒CNHK600-p53可增强肝癌细胞株SMMC7721对化疗药物的敏感性

目的构建携带p53基因新型增殖性腺病毒CNHK600-p53,研究其是否增加肝癌细胞株对化疗药物的敏感性。方法采用四甲基偶氮唑盐(m ethylth iazolyl tetrazolium assay,MTT),观察化疗药物5-氟尿嘧啶(F luorourac il,5-Fu)、丝裂霉素(M itomyc in,MMC)和表阿霉素(Ep irub ic in,EPI)组与携带p53基因的重组腺病毒CNHK600-p53联合上述化疗药物组对肝癌细胞株SMMC7721的杀伤效应,同时观察其是否优于Ad-p53。结果单用CNHK600-p53或Ad-p53对肝癌细胞SMMC7721的杀伤效果无明显差别;肝癌细胞株SMMC7721在5-Fu浓度为100 ug/m l时细胞抑制率为58%,MMC浓度为2.5 ug/m l时细胞抑制率为50%,EPI浓度为1.25ug/m l时细胞抑制率为57%,但转入CNHK600-p53(MO I=10)后再使用上述浓度的化疗药物,细胞抑制率分别为76%、60%和62%。结论单用CNHK600-p53或Ad-p53对肝癌细胞SMMC7721的杀伤效果无明显差别,携带p53基因的CNHK600-p53能提高肝癌细胞株SMMC7721对化疗药物的敏感性,CNHK600-p53联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径。     

FasL、B7-1联合基因修饰的胃癌细胞诱导抗胃癌主动免疫的研究

目的 探讨FasL、B7-1联合基因转移是否具有协同的抗肿瘤效应。方法 采用重组腺病毒载体将FasL、B7-1基因导入人胃癌细胞SGC-7901,G418阳性克隆筛选,流式细胞分析,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),显示FasL和B7-1的表达,并且通过Hoechst33342染色检测胃癌细胞凋亡;将携带 FasL和 B7-1基因的胃癌细胞(命名为 SGC-7901/FB-11)接种于 C57BL/6小鼠背部皮下,观测其致瘤性能;SGC-7901/FB-11致敏的小鼠对野生型瘤细胞是否具有免疫保护作用;用SGC-7901和 SGC-7901/FB-11细胞分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤实验。结果 FasL和B7-1基因在胃癌细胞中获得高表达并可诱导胃癌细胞的凋亡,双基因转染的胃癌细胞的致瘤性明显下降;SGC-7901/FB-11诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对SGC-7901的杀伤活性显著高于野生型SGC-7901诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性(P<0.05);SGC-7901/FB-11诱导的 CTL对 SGC-7901/FB-11的杀伤率显著高于对野生型 SGC-7901的杀伤率(P<0.05)。结论 FasL促进胃癌细胞凋亡,B7-1促进抗胃癌CTL的增殖、活化,在效应阶段两基因发挥着重要的协同作用。     

非增殖型和靶向增殖型腺病毒携带TRAIL基因治疗肝癌的实验研究

目的比较携带人TRAIL基因的增殖型腺病毒（CNHK500-hTRAIL）和非增殖型腺病毒（Ad-hTRAIL）对TRAIL基因的表达以及对SMMC-7721肝癌细胞的杀伤能力。方法通过病毒增殖实验评估增殖型腺病毒CNHK500-hTRAIL的选择性增殖能力。通过MTT实验,评估增殖型腺病毒CNHK500-hTRAIL以及非增殖型腺病毒Ad-hTRAIL对人正常肝细胞株L02、人肝癌细胞株SMMC-7721的杀伤能力。采用ELISA法检测CNHK500-hTRAIL和Ad-hTRAIL感染SMMC-7721肝癌细胞后TRAIL基因的表达情况。以及通过流式细胞术（FCM）检测其对细胞早期凋亡的影响。结果CNHK500-hTRAIL能选择性地在SMMC-7721细胞内大量增殖,感染96 h后增殖达225137倍,在极低的MOI值（MOI=0.1）即可大量杀伤SMMC-7721细胞,明显强于Ad-hTRAIL,而对L02细胞无明显杀伤。CNHK500-hTRAIL和Ad-hTRAIL感染SMMC-7721细胞后,其TRAIL基因表达量,前者是后者的近10倍;CNHK500-hTRAIL可选择性地诱导SMMC-7721细胞早期凋亡,其能力显著高于Ad-hTRAIL。结论靶向增殖型腺病毒载体携带TRAIL基因对肿瘤细胞的杀伤能力和目的基因的表达,明显优于传统的非增殖型腺病毒载体,应用前景广阔。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。     

增殖性腺病毒CNHK600-p53的构建及对肝癌细胞抑制的体外实验研究

目的研究携带p53基因的新型增殖性腺病毒CNHK600-p53的导入是否增加肝癌细胞株PLC／PRF5对化疗药物的敏感性。方法采用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium assay,MTT)法,观察化疗药物5-氟尿嘧啶(Fluorouracil,5-Fu)、丝裂霉素(Mitomycin,MMC)和表阿霉素(Epirubicin,EPI)单独及与CNHK600-p53联合对肝癌细胞株PLC／PRF5的杀伤效应。结果PLC／PRF5在5-Fu浓度为400μg／ml时细胞抑制率为(65±4．2)％,MMC浓度为1μg／ml细胞抑制率为(41±1．9)％,EPI浓度为10μg／ml细胞抑制率为(65±1．8)％。转入CNHK600-p53(MOI= 0．625)后再使用上述浓度的化疗药物,细胞抑制率分别为(89±5．3)％、(60±2．3)％和(75±1．5)％。当MOI值为0．3125,0．625,1．25时,CNHK600-p53组和Ad-p53组的细胞抑制率分别为(27±2．5)％、(30±3．7)％、(61±4．3)％和(4±2．7)％、(5±3．5)％、(16±4．5)％。结论单用CNHK600-p53效果优于Ad-p53,携带p53基因的CNHK600-p53能提高肝癌细胞株PLC／PRF5对化疗药物的敏感性。     

金雀异黄素与5-氟尿嘧啶对SGC-7901细胞的抑制作用

目的研究金雀异黄素（genistein，Gen）与5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）对人胃癌细胞SGC-7901的抑制作用。方法采用MTT法检测Gen和5-FU对SGC-7901细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞周期分布，并在透射电镜下观察细胞超微结构改变。结果Gen和5-Fu单用或联合应用对胃癌SGC-7901细胞的生长均有显著的增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。两药联合应用时，当药物效应在0．2～0．8时，具有协同或相加作用（CI≤1）；18．8btmol／L的Gen作用后，62．97％的SGC-7901细胞阻滞在G2／M期；8．84μmol／L的5-FU作用后，63．76％的SGC-7901细胞阻滞在s期；3．06μmol／L的Gen与7．96μmol／L的5-Fu联合应用后，67．46％的SGC-7901细胞阻滞在G0／G1期。Gen和5-FU均可诱导SGC-7901细胞凋亡。结论Gen与5-FU通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制胃癌细胞的生长，对胃癌细胞的增殖抑制具有协同作用。     

白细胞介素12基因治疗结肠癌的实验研究

目的观察携白细胞介素12(mIL-12)基因逆转录病毒载体的包装细胞(PA317-mIL-12)瘤内注射后,对肿瘤生长的抑制及对荷瘤动物生存的影响。方法在非免疫缺陷的结肠癌动物模型上分别施以化疗、放射免疫(放免)导向治疗、PA317-mIL-12基因治疗以及放免导向与IL-12基因联合治疗,比较各治疗组的肿瘤抑制效果和荷瘤动物的生存情况。结果经筛选后的携有mIL-12逆转录病毒载体包装细胞系PA317-mIL-12的上清,mIL-12浓度48h达27ng/106细胞。治疗3周后,IL-12基因治疗组(GT组)和IL-12基因与RIT联合治疗组(GT加RIT组)无论瘤体积还是瘤重量均明显低于对照组,生存率明显高于对照组(P<0.01)。结论PA317-mIL-12瘤内注射可有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤动物的生存时间。基因治疗疗效优于化疗、放免导向治疗。放免导向与IL-12基因联合治疗疗效更佳。     

索拉菲尼对人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡和P-ERK表达的影响

目的：探讨多分子靶向药物索拉菲尼（sorafenib）对体外人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡的影响及对癌细胞P-ERK表达的影响,并探讨其可能机制。 方法：以MTT法检测索拉菲尼对SGC-7901细胞的杀伤抑制作用;免疫细胞化学法检测胃癌细胞内P-ERK蛋白的表达;流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡的变化情况。 结果：索拉菲尼对胃癌细胞生长增殖具有抑制作用,随药物浓度的增加作用也增强,呈剂量—时间双效应关系(P<0.05);经索拉菲尼处理的SGC-7901细胞的P-ERK表达明显下降(P<0.05);细胞凋亡率增高(P<0.05)。 结论：sorafenib在体外对SGC-7901细胞具有明显的抑制作用,主要机制为抑制其P-ERK表达,从而抑制其增殖和促进凋亡。     

多重调控病毒.基因载体的构建及其体外抗肿瘤活性

目的 构建一种新型的病毒.基因治疗载体.方法 通过克隆技术将人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因插入质粒载体pBHGE3的E3区,得到由主要晚期启动子(MLP)调控的腺病毒质粒pPE3-hTRAIL,再通过与质粒pSGS00在293细胞中进行位点特异性重组得到E1A、E1B基因分别受hTERT启动子与HRE启动子双重调控的重组增殖型腺病毒,用TCID50方法测定病毒滴度.通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人TRAIL基因的表达.并进行噻唑蓝(MTT)比色法实验检测其杀伤肿瘤细胞的能力.结果 CNHK500-hTRAIL的病毒滴度为2.39×1010pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hTRAIL可以选择性地在端粒酶阳性的人肺癌细胞A549中增殖,其所携带的人TRAIL基因在A549中的表达量(183.12μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL(24.53μg/L,P<0.01).MTr显示CNHK500-hTRAIL对A549的杀伤能力明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL,其半数抑制MOI值分别为17.825、0.197(P<0.01).结论 CNHKS00一hTRAIL是一种具备治疗肺癌潜力的新型病毒-基因治疗系统.     

Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究

目的：观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：采用脂质体lipofec-tamine2000介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western-blot法检测未转染对照组、空载体pcDNA3．1转染对照组、pcDNA3．1-Smac转染组胃癌细胞中Smac基因的表达。选用紫杉醇（1、5、10ug／mL）处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄片。结果：同未转染对照组和空载体pcDNA31转染对照组比较,pcDNA31-Smac转染组SGC-7901细胞SmacmRNA和蛋白表达水平显著增高（F）〈O01）;紫杉醣处理24、48h后,pcDNA3．1-Smac转染组细胞生长抑制率增加（P〈O01）;使用化疗药物后,细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,pcDNA3．1-Smac转染组细胞形态变化最为显著。结论：转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达,能提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。     

腺病毒载体介导的早幼粒细胞白血病基因生长抑制因子诱导胃癌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨腺病毒载体介导的早幼粒细胞白血病基因（PML）生长抑制因子诱导胃癌细胞凋亡作用的机制。方法 将人PML全长cDNA插入穿梭质粒pSGCMV，再与腺病毒骨架质粒pPE3共转染293细胞后获得重组病毒。用重组病毒感染胃癌细胞系SGC-7901，采用噻唑蓝比色法、流式细胞术以及免疫细胞化学法对p53和bcl-2在肿瘤细胞内的表达以及细胞凋亡的定性与定量指标进行检测。结果 经腺病毒介导的PML处理的SGC-7901细胞生长受到明显抑制，凋亡细胞发生率升高，且与MOI值呈正相关，MOI值由5增加到20，细胞的生长抑制率从22．4％增加到38．5％，而细胞凋亡率从37．2％增加到49．8％。经腺病毒介导的PML处理的SGC-7901细胞内p53蛋白表达较对照组明显增加，bel-2蛋白的表达则无明显变化。结论 腺病毒介导的PML对胃癌细胞的杀伤主要是通过诱导细胞凋亡，p53蛋白高表达为其诱发胃癌细胞凋亡的机制之一。     

D-甲硫氨酸联合化疗药物诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨甲硫氨酸(Met)及其联合化疗药物对胃癌细胞凋亡的诱导作用。方法将人胃癌细胞株SGC-7901分别置于6种不同培养液:含L-Met、含D-Met、不含Met而替以同型半胱氨酸(Met-Hcy )或在上述培养液中分别加入氟尿嘧啶(5-Fu)。培养48h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达,并在电镜下观察细胞形态变化。结果无论是否加入化疗药物,D-Met组的细胞凋亡率均高于Met-Hcy 组和L-Met组;L-Met加5-Fu组的细胞凋亡率显著高于L-Met组和Met-Hcy 组,但与D-Met组差异无显著性意义。各组间的bcl-2和bax表达率无改变。结论D-Met及D-Met联合化疗药物可通过诱导胃癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长,作用机制可能与bcl-2和bax的表达无关。     

腺病毒介导的靶向蛋白激酶B1和环氧合酶2短发夹RNA抑制人胃腺癌细胞的侵袭和转移

目的 构建靶向性蛋白激酶B1(Aktl)和环氧合酶2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对SGC-7901人胃腺癌细胞侵袭和转移的抑制效果.方法 构建腺病毒载体pGSadeno-Aktl+COX-2(rAd5-A+C)并体外转染SGC-7901人胃癌细胞株后,用实时定量PCR和蛋白印迹分别检测对照组SGC-7901、空载组rAd5-HK和治疗组rAd5-A+C中Aktl、COX-2 mRNA和蛋白质的表达,其中以对照组SGC-7901、空载组rAd5-HK作为阴性对照.用ELISA法分别检测它们的MMP-2和MMP-9含量;用Transwell法分析它们的侵袭和转移能力.结果 构建的rAd5-A+C重组腺病毒载体在转染SGC-7901细胞48 h后可显著抑制Aktl和COX-2 mRNA的表达,而治疗组rAd5-A+C的Aktl和COX-2蛋白表达量与对照组和空载组相比分别下调68.4%和60.2%(均P<0.01);rAd5-A+C组中MMP-2和MMP-9含量分别为(39.7±1.7)ng/ml(31.3±3.6)ng/ml,明显低于对照组SGC-7901(278.4±15.5)ng/ml(225.4±15.1)ng/ml和卒载组rAd5-HK(275.5±2.1)ng/ml、(226.0±23.3)ng/ml(P=0.01、P=0.021).结论 腺病毒介导的靶向性Aktl和COX-2shRNA可抑制人胃腺癌细胞的侵袭和转移.     

蛋白激酶B siRNA 转染对胃癌SGC-7901细胞生长增殖的影响

目的:探讨蛋白激酶B（PKB）基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用。 方法:应用基因转染技术将蛋白激酶B家族的Akt2 siRNA转染至胃癌细胞中，采用Western blot、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术MTT等方法观察和检测Akt2 siRNA转染后对转染组细胞生长和增殖的影响。结果:与对照组比较，转染Akt2 siRNA组的胃癌SGC-7901细胞生长、增殖速度明显减缓（P＜0.01）， Akt2 siRNA组较对照组细胞的Akt2蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）;转染组出现梯状凋亡条带;细胞周期显示转染组细胞聚集在G2/M期。 结论:应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能使人胃癌SGC－7901细胞的生长受到抑制，胃癌细胞增殖速度减缓，其作用机理可能通过诱导细胞凋亡和抑制PI3/K信号传导通路而实现。Akt2有望成为胃癌基因治疗的新靶点。     

TNF-α联合奥沙利铂对胃癌细胞SGC-7901抑制作用的研究

目的:探讨TNF-α联合奥沙利铂对人胃癌细胞株SGC-7901生长抑制、凋亡的影响及其作用机制。方法:应用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的TNF-α、奥沙利铂及两者联合应用对SGC-7901细胞抑制率;采用Hoechst检测SGC-7901细胞凋亡情况。结果:浓度为20、40、80和160μg/mL的奥沙利铂对SGC-7901的细胞生长抑制率为(29.11±0.63)%、(41.05±0.97)%、(47.69±1.03)%和(56.26±0.93)%,均可抑制细胞增殖(P<0.01);浓度为25 mg/L的TNF-α对SGC-7901细胞的生长抑制率为(2.39±0.65)%,抑制作用不明显,浓度为50、100、150 mg/L的TNF-α对SGC-7901细胞的生长抑制率为(4.51±0.86)%、(4.63±0.53)%和(4.75±1.05)%,可抑制细胞增殖(P<0.05);奥沙利铂(20μg/mL)与25、50、100和150 mg/L的TNF-α联合应用时对SGC-7901的细胞生长抑制率为(36.34±0.76)%、(45.51±0.83)%、(51.47±0.67)%和(58.78±0.97)%,与单用TNF-α(100mg/L)或奥沙利铂(20μg/mL)比较,细胞生长抑制率增加(P<0.01);Hoechst检测结果显示,单独应用100 mg/L TNF-α、单独应用20μg/mL奥沙利铂及两者联合应用均有细胞凋亡现象,且联合用药组细胞凋亡率增高(P<0.01)。结论:TNF-α可增强奥沙利铂对人SGC-7901细胞的促凋亡作用,其机制可能为TNF-α、奥沙利铂分别激活不同的Caspase,并级联和放大有关凋亡信号,因而对细胞凋亡产生了协同作用。     

不平衡支链氨基酸对胃癌细胞体外增殖和化疗敏感性的影响

目的 为观察不平衡支链氨基酸对胃癌细胞体外增殖和对化疗药物5－FU、MMC和MTX敏感性的影响，为肿瘤的氨基酸失衡疗法提供实验和理论基础。方法 在不含L－Val的MEM培养基基础上，以普通MEM培养基L－Val(46mg/L）和L－Leu含量（52mg/L）为准，配制12种限制L－Val、增加L－Leu的不平衡支链氨基酸培养基，用MTT法观察其对胃癌细胞株SGC－7901体外增殖的影响和对该细胞株化疗药物敏感性的影响。结果 限制L－Val至正常的1／4对SGC－7901细胞即有明显的抑制作用（p<0.01），随着L－Val浓度的进一步降低，抑制作用更加显，增加L－Leu至正常的4倍，可显增强L－Val缺乏对SGC－7901细胞的抑制作用。不平衡支链氨基酸可提高化疗药物5－FU、MMC和MTX对SGC－7901的杀伤作用。结论 不平衡支链氨基酸对胃癌细胞体外增殖有抑制作用，与化疗药物有协同抗肿瘤效应，在肿瘤的氨基酸失衡疗法中，不仅要调某种氨基酸的绝对量，更重要的是调整该氨基酸与其他氨基酸的比例关系。     

D-甲硫氨酸联合化疗对胃癌细胞株代谢周期的影响

目的:通过体外实验观察D-甲硫氨酸(D-Met)合并应用细胞周期特异性化疗药物对胃癌细胞株代谢周期的影响。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901分别置于含L-Met、D-Met或以同型半胱氨酸替代Met(Met-Hcy+)的不同培养基中,或在上述诸培养基中分别加入5-氟脲嘧啶(5-FU)。培养48h后,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞的比例。结果:G0/G1期和G2/M期细胞的比例均示D-Met和Met-Hcy+组低于L-Met组,而S期细胞比例则示D-Met组最高,凋亡细胞比例也以D-Met组诸组为最高;与未加入化疗药物诸组相比,联合应用5-FU后,各组的G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期细胞比例降低,凋亡细胞比例有所增高。结论:D-Met可干扰人胃癌细胞株的代谢周期,趋向阻滞肿瘤细胞于S期,有助于周期特异性化疗药物5-FU对此期肿瘤细胞的杀份。